鯉魚主要組織中金屬硫蛋白提取工藝的研究

李 華，許曉曦，* ，呂萍萍，邵欣欣，關(guān)朝亮

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.綏芬河出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江綏芬河157300)

金屬硫蛋白(Metallothionein，簡(jiǎn)稱MT)是一類廣泛存在于生物體中的低分子量、富含半胱氨酸的、能被金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白。廣泛存在于生物界，它涉及許多生理和病理學(xué)過(guò)程，具有重要的生物學(xué)功能［1-2］。自從1957年Margashes和Vallee首次發(fā)現(xiàn)MT以來(lái)，MT成為基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，其研究和開發(fā)涉及農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健、生物工程、環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域［3］。對(duì)于金屬硫蛋白(MT)的研究，國(guó)內(nèi)外主要集中在實(shí)驗(yàn)室提取、純化和檢測(cè)以及應(yīng)用上。在實(shí)際生產(chǎn)中，目前主要靠用金屬鎘或鋅等金屬誘導(dǎo)動(dòng)物肝臟合成，然后經(jīng)提取、分離純化來(lái)制備Cd-MT［4-5］。由于受到誘導(dǎo)和提取方法的限制，分離純化后的金屬硫蛋白中還含有其它的雜蛋白，產(chǎn)率低，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)及工業(yè)化，大大影響了MT的開發(fā)應(yīng)用。我國(guó)是漁業(yè)大國(guó)，有豐富的魚類資源，因而開發(fā)利用魚體內(nèi)的金屬硫蛋白具有廣闊的前景，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于魚類資源批量誘導(dǎo)提取MT進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)有關(guān)研究相對(duì)較少。誘導(dǎo)和提取工藝不夠理想是制備Cd-MT產(chǎn)率低的主要原因，目前對(duì)Cd-MT的誘導(dǎo)，主要采取動(dòng)物注射的方法，由于注射的劑量和時(shí)間的差異，動(dòng)物體內(nèi)的金屬硫蛋白合成不穩(wěn)定，造成資源浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)綜合傳統(tǒng)動(dòng)物金屬硫蛋白提取方法。以金屬離子溶液養(yǎng)殖模式誘導(dǎo)鯉魚體內(nèi)金屬硫蛋白的合成，解決了實(shí)驗(yàn)室少量金屬硫蛋白的提取的局限性，有助于工業(yè)化大規(guī)模提取鯉魚體內(nèi)的金屬硫蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚(Cyprinus carpioi) 當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買，平均體長(zhǎng)(12.4±0.4)cm，平均體重(42.1±0.5)g，鯉魚在經(jīng)曝氣3d的自來(lái)水中暫養(yǎng)14d，然后選取體表無(wú)傷，身體健康的個(gè)體供實(shí)驗(yàn)所用。研究器官肝、腎、腮、心臟和腦;自來(lái)水中未檢出Cd金屬離子，溶氧(DO)大于7mg/L，pH6.8～7.4，實(shí)驗(yàn)期間水溫為 20～25℃，同時(shí)保持自然光照;HNO3(濃)、HClO4、三羥甲基氨基甲烷 (簡(jiǎn) 稱 Tris)、HCl、CdCl2、CHCl3、無(wú) 水 乙 醇(95%)等試劑 均為分析純、硝酸+高氯酸混合酸(4∶1)，牛血清白蛋白，HRP-羊抗兔 IgG，兔抗魚 MT多克隆抗體，Ellman’試劑DTNB(Sigma)，鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0mg/mL)，鎘標(biāo)準(zhǔn)使用液(100.0ng/mL)，牛血紅蛋白等。

PE-800型原子吸收分光光度計(jì) 美國(guó)珀金埃爾默公司;PHS-3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;TGL18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;可調(diào)試恒溫電熱板、可調(diào)試電爐

上海特成機(jī)械設(shè)備有限公司;101C-1B型電熱鼓風(fēng)干燥箱 金華雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司;電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;酶標(biāo)板(NUNC，F(xiàn)16)、酶標(biāo)儀 杭州生友生物技術(shù)有限公司;勻漿機(jī) 南京萊步科技實(shí)業(yè)有限公司;磁力攪拌器 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司;電熱恒溫水浴鍋

北京東方精瑞公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Cd-MT的誘導(dǎo) 根據(jù)蛋白質(zhì)的提取理論和傳統(tǒng)生物體金屬硫蛋白的誘導(dǎo)方法［6-10］首先進(jìn)行鯉魚MT誘導(dǎo)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，從時(shí)效性、提取量、提取條件等方面綜合考慮，確定了以傳統(tǒng)經(jīng)典方法為主線的鯉魚MT的提取工藝。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cd2+(10mg/L)，誘導(dǎo)時(shí)間為兩周時(shí)，鯉魚體內(nèi)鎘-金屬硫蛋白能穩(wěn)定達(dá)到最大。故確定誘導(dǎo)方法為:選取鯉魚，放入含Cd2+(10mg/L)金屬離子濃度進(jìn)行批量誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為2周，期間不喂食，然后取出解剖取實(shí)驗(yàn)器官(肝、腎、腮、心臟和腦)，-20℃冷凍。

1.2.2 Cd-MT的提取與分離 在提取工藝中，MT的提取大致可分為勻漿與除雜兩步，近幾十年來(lái)，一直采用勻漿離心法提取動(dòng)物MT，Tris-HCl緩沖溶液性質(zhì)穩(wěn)定，與生理體液的相容性好［8］，因此Tris-HCl緩沖液常作為提取劑。有些研究中Tris-HCl緩沖液含有0.15mol/L NaCl以促進(jìn)蛋白溶解，及蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF，0.1、0.2mmol/L)、還原劑二硫蘇糖醇(DTT，1mmol/L)或B2巰基乙醇(10mmol/L)，以保護(hù)MT的巰基(-SH)不被降解或氧化，被提取的組織與所加緩沖液的質(zhì)量體積比(g/mL)一般為1/2～1/5［8，11］。但是不同研究者所使用的緩沖液的濃度、pH以及動(dòng)物組織與緩沖液的質(zhì)量體積比各不相同，勻漿液的離心轉(zhuǎn)速、時(shí)間以及離心后上清液的加熱處理?xiàng)l件也存在較大差異［12-15］。所以提取的MT含量和純度等都不一樣，這種狀況十分不利于MT對(duì)水域重金屬污染的指示作用。

1.2.2.1 勻漿過(guò)程中對(duì)MT提取的影響 勻漿過(guò)程中影響MT提取率的因素包括:Tris-HCl緩沖液濃度、pH、所用組織與緩沖液的質(zhì)量體積比(m/v)，而內(nèi)臟組織與緩沖液的質(zhì)量體積比(m/v)對(duì)MT提取率的影響最小［11］，在實(shí)驗(yàn)中不做考慮。因此，分別稱取約0.2g內(nèi)臟組織加入一定體積4℃預(yù)冷的Tirs-HCl緩沖液進(jìn)行勻漿，對(duì)緩沖液濃度、pH設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化勻漿條件。所得到的勻漿液均采用相同的除雜步驟進(jìn)行處理。即:變性除雜蛋白，10000r/min于4℃離心30min，棄沉淀，取上清液，85℃水浴熱變性5min，冰水冷卻，用8層紗布過(guò)濾，取清液，靜置約2h、8000r/min于4℃離心10min，棄沉淀，取上清液，得到所要的勻漿液，記下體積V，精確到1mL，每組設(shè)5個(gè)平行。按照1.2.5節(jié)的方法測(cè)定疏基含量。

1.2.2.2 除雜過(guò)程中對(duì)MT提取的影響 除雜過(guò)程中，水浴加熱的目的是利用MT的熱穩(wěn)定性去除勻漿液中的熱不穩(wěn)定大分子蛋白，而離心僅為獲得上清液的1種手段。該過(guò)程雖然不會(huì)影響MT提取率，但是水浴加熱時(shí)間、離心時(shí)間等因素決定著提取液中對(duì)MT測(cè)定有干擾的雜質(zhì)(大分子蛋白質(zhì)、熱敏蛋白以及含-SH的小分子物質(zhì))去除程度［11］。因此，依次采用單因素影響實(shí)驗(yàn)對(duì)這些因素進(jìn)行優(yōu)化，按照1.2.2.1的條件制備內(nèi)臟勻漿液，在依次控制1次離心時(shí)間10～70min、水浴加熱時(shí)間5～30min、2次離心時(shí)間為10～70min的情況下，對(duì)勻漿液進(jìn)行處理，所得到的上清液按照1.2.5的方法測(cè)定琉基含量，每組設(shè)5個(gè)平行。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定鯉魚MT含量 取鯉魚的肝臟和腎臟為例，以上述方法制備勻漿后，取上清液以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)［16］測(cè)定MT含量。以包被液按1∶100稀釋后，加100μL于酶標(biāo)板的凹孔中，加蓋4℃過(guò)夜，以p H7.4 Tris-HCl(內(nèi)含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的Tween-20)緩沖液洗滌3次;加入封閉液(1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白)200μL，37℃，1h后洗滌 3次;加入 100μL兔抗魚 MT多克隆抗體(1∶1000 倍)37℃，2h，以緩沖液洗滌3 次，將 HRP-羊抗兔IgG抗體(1∶1000稀釋)100μL加入孔內(nèi)，37℃，1.5h，以緩沖液洗滌3次，蒸餾水洗滌3次，孔內(nèi)加入100μL TMB應(yīng)用液，室溫放置 15min后，再加入50μL 2mol/L H2SO4，5min 后測(cè) A450，并與血紅蛋白/鎘飽和法比較其結(jié)果。

1.2.4 鎘含量測(cè)定 按文獻(xiàn)方法［17］，精密吸取魚標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，用去離子水定量稀釋(使Cd濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi))，搖勻。原子吸收分光光度計(jì)上測(cè)得吸光度，按肝臟重計(jì)算鎘的提取量(mg Cd/g濕肝)。對(duì)魚肝用濕法消化后，稀釋，測(cè)定肝中鎘含量。

表1 鯉魚不同組織中MT含量(mg/g，n=5)Table 1 The content of MT in carps for different tissues(mg/g，n=5)

表2 ELISA法和鎘-血紅蛋白飽和法測(cè)定MT含量(mg/g，n=5)Table 2 Determination of concentration MT with ELISA and Cadmium/hemoglobin saturation method(mg/g，n=5)

1.2.5 巰基含量的測(cè)定 Ellman’試劑檢測(cè)［18］，MT具有疏基(-SH)含量高的特點(diǎn)。稱取一定量鯉魚MT樣品(疏基含量0.1～0.5μmol)，配成小于 50μL 溶液。加入 10μL 1.2mol/L HCl和 200μL 0.1mol/L EDTA反應(yīng)10min脫去金屬。加入200μL Ellman’s試劑(含 5mmol/L DTNB，1mmol/L EDTA，6mol/L 鹽酸胍，0.1mol/L PBS，pH7.3)，混勻3min使MT 變性后與DTNB形成黃色絡(luò)合物，用0.1mol/L PBS，p H7.3稀釋至4mL在412nm處測(cè)紫外吸光度A，同時(shí)以50μL提取劑代替樣品提取液，按同樣步驟進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)得到吸光度A0。以ΔA(A-A0)表征組織中的MT水平。

1.2.6 鯉魚MT氨基酸組成分析 將0.1mg樣品溶于0.5mL蒸餾水中，加0.4mL，5.7mol/L恒沸HCl，抽真空封口，于110℃下分別水解24、48和72h，再經(jīng)處理上氨基酸分析儀分析。

1.2.7 計(jì)算 收率計(jì)算:因 1mol MT(分子量9799［19］)可結(jié)合 7mol Cd2+(原子量 112.4)，故鯉魚每克組織中的 MT 含量(μg·g-1)為［20］

式中:CCd為上清液中 Cd2+的質(zhì)量濃度，μg·mL-1;CKB為空白樣品最終上清液讀數(shù);S為測(cè)定時(shí)所取上清液的體積，mL;G為取樣組織的質(zhì)量，g;V為組織勻漿體積，mL;N為勻漿后的取樣體積，mL。

疏基濃度計(jì)算:C=DA/ε，式中 ε=1.23×104(mol/L)-1·cm-1，A 為吸光值，D 為稀釋倍數(shù)［18］。

數(shù)據(jù)處理采用Excel7.0版及SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同時(shí)采用t-test進(jìn)行差異性和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鯉魚主要組織中MT分布與含量

鯉魚的肝臟、腎臟、腮、心臟和腦內(nèi)MT含量分布如表1，其結(jié)果表明鯉魚體內(nèi)能誘導(dǎo)合成大量的MT，并且MT含量在各組織中差異很大，尤其在肝臟和腎臟內(nèi)含量明顯突出(p＜0.05)。因此，與其他組織器官相比，肝臟和腎臟是吸收重金屬鎘最強(qiáng)的組織器官，這與大多研究的結(jié)果是一致的。反映了在鎘誘導(dǎo)下，MT合成在肝臟和腎臟旺盛，是絡(luò)合和積累鎘的主要器官。因此，對(duì)鯉魚體內(nèi)MT的誘導(dǎo)合成主要以肝腎臟合成量為標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法與血紅蛋白/鎘飽和法測(cè)定鯉魚組織MT含量比較

表2列出ELISA法和血紅蛋白/鎘飽和法測(cè)定鯉魚組織中MT含量的結(jié)果，ELISA法測(cè)定魚體MT比血紅蛋白/鎘飽和法的結(jié)果偏低，原因可能是由于兩種方法使用不同的標(biāo)樣(ELISA法以MT純品為標(biāo)樣，血紅蛋白/鎘飽和法以標(biāo)準(zhǔn)鎘為標(biāo)樣，用血紅蛋白去除鎘時(shí)有殘留的鎘)，結(jié)果引起偏差。

2.3 Cd－MT的提取影響因素分析

2.3.1 緩沖液濃度、pH對(duì)MT提取效果的影響 勻漿過(guò)程中緩沖溶液的1個(gè)作用是作為溶劑促進(jìn)被提取成分的溶出。由圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在其他條件相同的情況下，緩沖液濃度≥0.03mol/L的Tirs-HCl緩沖溶液所得到的吸光度遠(yuǎn)小于兩個(gè)較低濃度的提取效果。這是因?yàn)?，隨著Tris-HCl濃度的增高，溶液的離子強(qiáng)度增大，而較高的離子強(qiáng)度可造成蛋白沉淀［6］，并在隨后的離心過(guò)程中從上清液中去除，從而導(dǎo)致吸光度的降低。因此，為獲得較高M(jìn)T提取率，Tris-HCl緩沖溶液的濃度選用0.01mol/L或0.02mol/L為宜。

圖1 Tirs-HCl緩沖液濃度對(duì)提取液中MT含量的影響Fig.1 Effect of Tirs-HCl buffer concentration on MT content in the extract

緩沖液的另一個(gè)作用是為離體蛋白提供相對(duì)穩(wěn)定的pH環(huán)境，防止變性，蛋白質(zhì)在胞內(nèi)一般處于中性環(huán)境，因此采用p H6～8的緩沖溶液可有效防止離體蛋白質(zhì)變性［21］。據(jù)報(bào)道，水生生物MT的等電點(diǎn)在p H3.5～6.0之間［2］，如果緩沖液的 p H 與目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)(p I)一致，則蛋白質(zhì)因溶解度減少會(huì)發(fā)生聚集［6］。因此，本研究選用遠(yuǎn)離pI且能保持蛋白質(zhì)活性的緩沖溶液pH范圍(7.4～9.0)進(jìn)行優(yōu)化。從圖2可知，當(dāng)緩沖液p H為8.6時(shí)，鯉魚MT的測(cè)定值最大，說(shuō)明這種p H最有利于MT的穩(wěn)定，既能避免等電點(diǎn)附近出現(xiàn)的蛋白沉淀，又可避免較高pH條件下的蛋白變性，由此確定Tris-HCl溶液最佳的pH為8.6。

圖2 Tris-HCl溶液pH對(duì)提取液中MT含量的影響Fig.2 Effect of Tirs-HCl buffer pH on MT content in the extract

綜上，鯉魚組織的最佳勻漿條件為:Tris-HCl緩沖溶液濃度為0.01mol/L，p H8.6，內(nèi)臟組織與緩沖液的質(zhì)量體積比為 1/2［4］。

2.3.2 水浴、離心時(shí)間對(duì)MT提取效果的影響

2.3.2.2 一次離心的時(shí)間對(duì)MT提取效果的影響由圖3可見，控制離心時(shí)間為10～20min時(shí)，吸光度測(cè)定值較高，表明能夠產(chǎn)生干擾的含-SH雜質(zhì)不能完全被去除;當(dāng)離心時(shí)間為30min時(shí)，吸光度顯著降低(p＜0.05)，說(shuō)明延長(zhǎng)離心時(shí)間有利于雜質(zhì)的沉降去除;繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，吸光度趨于平緩，沒有顯著變化(p＞0.05)。因此，離心時(shí)間以30min為宜。

圖3 一次離心時(shí)間對(duì)提取液中MT含量的影響Fig.3 Effect of centrifugal time during the first centrifugation on MT content in the extract

2.3.2.3 水浴加熱時(shí)間對(duì)MT提取效果的影響 MT分子的構(gòu)象較為堅(jiān)固，具有較強(qiáng)的耐熱性，可以80℃水中保存30min［22］不變性，而大多數(shù)種類的蛋白質(zhì)在溫度高40～50℃時(shí)即開始變性［23］。利用這一特性可去除熱不穩(wěn)定大分子蛋白，進(jìn)一步消除提取液中的干擾成分。考慮到溫度低于80℃時(shí)，非MT蛋白的變性不夠充分，而溫度太高時(shí)，MT中的-SH容易失活［24］，本研究選擇85℃水浴對(duì)上述離心后的上清液進(jìn)行處理。由圖4可見，水浴加熱5～15min時(shí)，吸光度保持在較高的穩(wěn)定水平，表明鯉魚MT在此時(shí)間內(nèi)不會(huì)失活;當(dāng)加熱超過(guò)15min時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度顯著降低(p＜0.05)，表明部分MT已發(fā)生熱變性。從保證加熱期間MT分子的穩(wěn)定性及有效分離其他蛋白質(zhì)兩方面考慮，選取最適水浴加熱時(shí)間為5min。

圖4 水浴加熱時(shí)間對(duì)提取液中MT含量的影響Fig.4 Effect of water-curing treatment time on MT content in the extract

2.3.2.4 二次離心時(shí)間對(duì)MT提取效果的影響 二次離心的目的是實(shí)現(xiàn)熱變性絮凝雜蛋白與提取劑的分離。一般在10000r/min時(shí)離心10min就能將細(xì)胞碎片、線粒體等物質(zhì)沉降［25］。為提高分離速度，在保持離心為8000r/min的情況下，對(duì)離心時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。由圖5可見，二次離心的時(shí)間對(duì)吸光度的測(cè)定值影響不大，在10～60min內(nèi)基本穩(wěn)定。為節(jié)省提取時(shí)間，二次離心的時(shí)間以10min為宜。

圖5 二次離心時(shí)間對(duì)提取液中MT含量的影響Fig.5 Effect of centrifugal time during the second centrifugation on MT content in the extract

因此，為獲得較高的MT提取率，鯉魚組織的最佳勻漿條件為:Tris-HCl緩沖溶液濃度為0.01mol/L，p H8.6，內(nèi)臟組織與緩沖液的質(zhì)量體積比為1/2，第一次離心10000r/min，30min，取上清液，置85℃水浴熱變性5min，進(jìn)行第二次離心8000r/min，10min。在此條件下鯉魚組織MT的提取率能達(dá)到最大，這些結(jié)果有助于重金屬生物監(jiān)測(cè)中鯉魚MT的經(jīng)濟(jì)高效提取和共存雜蛋白干擾的有效去除。

2.3 Cd－MT的提取結(jié)果

原子吸收分光光度計(jì)上測(cè)定其鎘濃度，按Cd-MT的分子質(zhì)量為6500u和每分子Cd-MT含7個(gè)鎘原子計(jì)算，得到Cd-MT的含量約為4.53mg/g濕肝，再以測(cè)得的巰基含量，按412nm外測(cè)紫外吸收值，得到Cd-MT的含量約為4.48mg/g濕肝。

2.4 鯉魚氨基酸組成分析

不同生物中誘導(dǎo)的MT性質(zhì)有所不同。表3～表4為鯉魚 MT 氨基酸組成與鯽魚［19］、海蝶［26］和小沙魚［27］的氨基酸組成的對(duì)比。其氨基酸成分分析結(jié)果表明:該蛋白中半胱胺酸為29.7%，約占1/3，與鯽魚、海蝶和小沙魚組成相似，然后依次是賴氨酸、絲氨酸等，未發(fā)現(xiàn)有芳香族氨基酸。用Ellman′試劑測(cè)定疏基的結(jié)果與此相同，這和李令媛等［28］研究大鯢MT含Cys約23%～24%結(jié)果相似，且都小于哺乳動(dòng)物MT的Cys含量。張建業(yè)等［29］以鋅誘導(dǎo)兔肝MT發(fā)現(xiàn)半胱氨酸含量有32%～33.8%，MT-I和MT-II分別結(jié)合7個(gè)和6個(gè)Zn，無(wú)Cd和Cu;人胎肝的MT含量較高(1.0～1.3)，且可能隨胎齡增長(zhǎng)發(fā)生某種變化。而郭詳學(xué)等［30］從藍(lán)藻中誘導(dǎo)純化的類金屬硫蛋白與哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白結(jié)構(gòu)差異很大，這可能只是一種進(jìn)化上的趨同。

表3 鯉魚MT的氨基酸組成(%)Table 3 Amino acid composition of carp MT(%)

表4 鯉魚與其他魚種氨基酸組成對(duì)比(%)Table 4 Amino acid composition of carp and other fish species contrast(%)

3 結(jié)論

3.1 本文利用鯉魚作為材料，研究體內(nèi)各組織MT的含量及批量誘導(dǎo)提取工藝，用于MT生產(chǎn)企業(yè)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出:鯉魚肝、臟、腮、心臟和腦中的MT含量較高，肝臟的含量也反映出肝臟是吸收和積累重金屬的主要器官，也是重金屬污染的最適指示器官，通過(guò)與其他魚類MT的氨基酸對(duì)比結(jié)果看出:鯉魚MT中也不含芳香族氨基酸，氨基酸殘基組成相似，含有大量的半胱氨酸。

3.2 采用血紅蛋白/鎘飽和法測(cè)定魚體MT，此方法操作簡(jiǎn)便、快速，但此方法有一定的局限性，即:特異性較差因?yàn)橹亟饘俳Y(jié)合MT的能力次序?yàn)锽i(Ⅲ)、Hg(Ⅱ)、Ag(Ⅰ)、Cu(Ⅱ)＞Cd(Ⅱ)＞Pb(Ⅱ)＞Zn(Ⅱ)，即不能用于 Bi、Hg、Cu-MT 樣品的測(cè)定，而且還與其它一些小分子量化合物結(jié)合，而ELISA法則適用于廣泛的樣品測(cè)定［9］。ELISA法可以特異地檢測(cè)出動(dòng)物組織勻漿液中微量的MT，是當(dāng)前檢測(cè)MT最靈敏的方法之一，由于這兩種方法具有不同的特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)上的局限性，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況而選擇不同的方法，也可以兩種方法并用，綜合作出評(píng)價(jià)。

3.3 采用單因素設(shè)計(jì)優(yōu)化鯉魚主要組織中MT的提取過(guò)程。在勻漿階段，最佳工藝條件為:Tris-HCl緩沖液的濃度0.01mol/L，pH8.6，內(nèi)臟組織與緩沖液的質(zhì)量體積比為1/2，在此條件下MT在緩沖液中的溶出量達(dá)到最大。除雜階段的最佳工藝條件為:勻漿液在10000r/min、4℃、離心30min，棄沉淀，取上清液，置85℃水浴熱變性5min，再次除雜蛋白，用冰水冷卻，用8層紗布過(guò)濾，取清液，靜置約2h、8000r/min于4℃離心10min，棄沉淀，取上清液，得到所要的勻漿液，記下體積V，精確到1mL。該優(yōu)化結(jié)果去除了影響MT測(cè)定的雜蛋白，為鯉魚MT應(yīng)用于企業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠、高效的提取方法。而且該提取方法操作簡(jiǎn)單，過(guò)程易于控制，將對(duì)科學(xué)研究和生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)與深加工具有重要意義。

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