14-3-3蛋白在植物碳氮代謝中的作用

何天久 ，宋波濤 ，夏錦慧 ，謝從華

（1.貴州省生物技術(shù)研究所，貴陽，550006；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

14-3-3蛋白最早由Moore B和Perez V于1967年在哺乳動(dòng)物腦部酸性可溶性蛋白中發(fā)現(xiàn)，并根據(jù)其在DEAE纖維素層析中的片段數(shù)與淀粉凝膠電泳中的位置命名[1]。其后約20 a時(shí)間里，人們普遍認(rèn)為14-3-3蛋白僅僅存在于動(dòng)物腦部，與神經(jīng)元的功能有關(guān)[2～4]。但是近期的研究表明，14-3-3蛋白存在于所有調(diào)查過的真核生物的所有器官和組織中[3]，含有14-3-3蛋白的組織數(shù)目之大，說明其功能涉及到許多生命活動(dòng)過程[2]；而在所有調(diào)查過的原核生物中都不存在。

14-3-3蛋白是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)質(zhì)檢相互作用的“橋梁”，能與多種蛋白質(zhì)相互作用，幾乎參與生命體的所有生理反應(yīng)過程。近年來越來越多的研究者對其在植物糖代謝中的調(diào)控作用開展了深入研究。本文根據(jù)近年來的研究進(jìn)展，就14-3-3蛋白在植物糖代謝的作用加以介紹，為進(jìn)一步研究14-3-3蛋白在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 14-3-3蛋白的結(jié)構(gòu)

14-3-3蛋白全長241～268個(gè)氨基酸，每一個(gè)14-3-3蛋白單體可以分為3個(gè)部分：氨基端、保守的中心區(qū)域（也有譯作核心區(qū)域）和羧基端，目前對14-3-3蛋白三維結(jié)構(gòu)的認(rèn)識來源于通過對哺乳動(dòng)物ζ和τ兩類同工型晶體X-射線衍射建立的模型，14-3-3蛋白保守區(qū)域氨基酸序列的高度保守性使得該模型可被應(yīng)用于所有已知的14-3-3蛋白[2]。14-3-3蛋白的三維結(jié)構(gòu)如圖1所示，每個(gè)單體各由9個(gè)螺旋構(gòu)成，呈L形，L形內(nèi)部由4個(gè)螺旋組成，A3和A5含有許多帶電或是極性的氨基酸，A7和A9含疏水氨基酸，這4個(gè)螺旋形成一個(gè)兩親性的凹槽，可與靶蛋白發(fā)生反應(yīng)，同源或異源的兩個(gè)單體按照反向平行排列，構(gòu)成完整的14-3-3蛋白[5]。對目前所知的各同工型的全長序列分析表明，14-3-3蛋白內(nèi)部凹槽的的保守性在70%以上，其中5個(gè)保守性最高的區(qū)域分別位于螺旋 A1、A3、A5、A7和A9上，該凹槽是14-3-3蛋白配體結(jié)合位點(diǎn)，也是其主要的功能區(qū)域[2]。14-3-3蛋白單體的二聚化反應(yīng)發(fā)生在一個(gè)單體的螺旋A1的氨基端和另一個(gè)單體的螺旋A3及A4之間[2,5]，各同工型間螺旋A1、A3上高度保守的氨基酸序列使得14-3-3蛋白可以形成異源二聚體，兩個(gè)相同或是不同的靶蛋白可以同時(shí)與二聚體結(jié)合，暗示14-3-3的功能可能包括作為銜接蛋白將分離的靶蛋白聚到一起，或者移動(dòng)/重排同一蛋白的不同功能域[2]。

圖1 14-3-3ζ蛋白與底物形成的復(fù)合體結(jié)構(gòu)示意圖[5]

對哺乳動(dòng)物絲氨酸/蘇氨酸激酶Raf-1與14-3-3蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的研究，發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)的一段共有序列RSxPSxP（x代表任意氨基酸，P代表磷酸化位點(diǎn)）[6]，該序列存在于所有被篩選的多肽文庫中[2]或者RXY/FXpSXP[7]。作為14-3-3蛋白配體的一個(gè)普遍但不絕對的特征是靶序列內(nèi)絲氨酸或蘇氨酸的磷酸化[2]。但是，并非所有可與14-3-3蛋白結(jié)合的配體都有磷酸化的共有序列，有的非磷酸化序列如GHSL，WLDL也可與之結(jié)合[8]。

對于具有磷酸化靶序列的受體蛋白而言，其靶序列與14-3-3蛋白的結(jié)合是信號傳導(dǎo)過程中的主要步驟[2]，靶序列磷酸化使得受體蛋白構(gòu)型發(fā)生改變，能夠與14-3-3蛋白結(jié)合，當(dāng)與14-3-3蛋白結(jié)合上之后，才使得受體蛋白構(gòu)型改變到完成信號傳導(dǎo)所需的狀態(tài)[3]。試驗(yàn)結(jié)果表明，14-3-3ζ序列中Lys49，Arg56，Arg127可與受體磷酸化的氨基酸反應(yīng)；無論是磷酸化受體還是非磷酸化受體都結(jié)合在兩親性凹槽內(nèi)[2]。

14-3-3蛋白中心區(qū)域高度保守，絕大多數(shù)變異發(fā)生于N和C端。事實(shí)上，N端氨基酸的保守性僅14%，而C端氨基酸僅有極小的保守性[3]。

2 14-3-3蛋白的種類

依據(jù)氨基酸序列和基因結(jié)構(gòu)，植物來源的14-3-3蛋白可以分為兩個(gè)亞類：ε類和非ε類[2,3]，隨著擬南芥全基因組測序的完成，通過分析，確定擬南芥14-3-3蛋白家族由13種同工型組成，其中ε類包括 5 個(gè)成員：μ、ε、π、ο、ρ，分為 2 個(gè)亞類：ε、π 屬于一個(gè)亞類，μ、ο、ρ屬于另一個(gè)亞類；非ε類包括8個(gè)成員：κ、λ、φ、ν、υ、ψ、χ、ω，分為 3 個(gè)亞類：κ、λ，φ、χ、ω，ν、υ、ψ， 在其他含有 14-3-3 蛋白的物種內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有類似的多樣性[2]。

在馬鈴薯中，已發(fā)現(xiàn)4種14-3-3蛋白同工型的全長序列和2種同工型的部分序列,包括16r、20r、 29g、30g、34g 和 35g[10]。 從 3 個(gè)分別來自葉片、表皮和根部的cDNA文庫中篩選到6個(gè)編碼14-3-3蛋白的全長cDNA序列，其氨基酸序列同源性高達(dá)65%～95%[11]。在同屬茄科的番茄中已發(fā)現(xiàn)了10種14-3-3蛋白同工型，通過系統(tǒng)比較，可以預(yù)言：馬鈴薯中存在與番茄TFT7、TFT8、TFT9同源的同工型，但是番茄葉片中的TFT8、TFT9在殼梭孢（菌）素處理時(shí)表現(xiàn)受到顯著的正調(diào)節(jié)，因此，馬鈴薯中與之同源的同工型可能在那些已檢測的普通組織來源的cDNA文庫中并不存在[12]。

3 14-3-3蛋白在植物體內(nèi)的表達(dá)與分布

3.1 14-3-3蛋白在植物體器官中的表達(dá)與分布

14-3-3蛋白廣泛分布于植物的各個(gè)器官和組織。Wilczynski等的研究表明，14-3-3蛋白在植物體內(nèi)的分布具有器官組織特異性，其表達(dá)受到發(fā)育階段的調(diào)節(jié)。該結(jié)論得到后續(xù)研究的支持，同時(shí)Western blot還表明馬鈴薯葉片中14-3-3mRNA的總含量隨著葉片的衰老而減少[10]。Szopa[9]利用Northern blot分析馬鈴薯中已知的6種14-3-3蛋白同工型在各個(gè)不同器官組織內(nèi)的分布情況，顯然，各同工型在不同的器官中表達(dá)量不同，同一器官中不同的同工型之間表達(dá)量存在很大的差異。分析各同工型在沿莖的相鄰葉片中的分布可以發(fā)現(xiàn)：除35g外，14-3-3蛋白的各同工型在葉片中的含量從生理上端到生理下端 （隨葉片生理年齡的增加）呈一定的梯度分布，說明14-3-3蛋白的表達(dá)可能受到所在組織的生理年齡的調(diào)控[9,12]，熒光蛋白標(biāo)記檢測也證明了上述結(jié)論[13]。

14-3-3蛋白表達(dá)的組織特異性是其啟動(dòng)子序列特征的反映。對馬鈴薯14-3-3蛋白同工型16R的假定啟動(dòng)子區(qū)的分析表明，多數(shù)功能區(qū)域都能被Dof蛋白、E/ABRE-like Box識別[9]。有研究表明，Dof蛋白在體內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域[13]；而在β-菜豆素基因啟動(dòng)子中，E-box定位于不同位點(diǎn)對基因表達(dá)起到協(xié)同調(diào)控的作用[14]；AGAAA序列在番茄花粉中隨發(fā)育進(jìn)程調(diào)節(jié)late 52基因的表達(dá)[15]；－300 element被證明是大麥醇溶蛋白、麥醇溶蛋白、麥谷蛋白基因的增強(qiáng)子元件，轉(zhuǎn)錄因子Jun和GCN4與該功能域結(jié)合[16]；ARE結(jié)合位點(diǎn)的存在使得16R啟動(dòng)子受到生長素IAA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)；而GATA Box、I-Box和GT1 box與高度的光調(diào)控和組織表達(dá)特異性有關(guān)，后者可以穩(wěn)定TFIIA-TBP-DNA復(fù)合體，SEF4結(jié)合位點(diǎn)的存在暗示這3種元件構(gòu)成一個(gè)增強(qiáng)子發(fā)揮作用[9]，類似于大豆基因編碼存儲(chǔ)蛋白時(shí)的情況[17]；14-3-3蛋白的高表達(dá)可能與SAR/MAR序列有關(guān)[18]，該序列與染色質(zhì)同核基質(zhì)的結(jié)合有關(guān)，而與核結(jié)構(gòu)結(jié)合的基因都是高度活化的；蔗糖調(diào)節(jié)基因中的保守序列AATAGAAAA可能對于啟動(dòng)子的活化很重要，因?yàn)橛薪Y(jié)果表明14-3-3蛋白同工型16R基因受蔗糖含量或是蔗糖代謝產(chǎn)物的控制，14-3-3蛋白的活性可能與韌皮部的裝載有關(guān)[9]。

3.2 14-3-3蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的分布

14-3-3蛋白廣泛分布在細(xì)胞內(nèi)，這與它作為各種成分參與到多種蛋白質(zhì)間的相互作用的觀點(diǎn)相符合，但是，某些特殊的亞細(xì)胞定位表明某些同工型具有特化的組分。利用同工型特異的抗體及14-3-3蛋白與綠色熒光蛋白融合獲得了擬南芥中8類同工型的亞細(xì)胞定位，表明特定的同工型有特異的細(xì)胞內(nèi)定位，同時(shí)，擬南芥的5條染色體上都至少有1種14-3-3蛋白同工型分布[2]。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，通過羧基端融合綠色熒光蛋白對同工型κ和υ的定位研究表明，同工型κ趨向于定位在原生質(zhì)膜，而同工型υ則趨向于定位在細(xì)胞質(zhì)中[19]。通過免疫顯微技術(shù)對細(xì)胞核內(nèi)容物的檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)至少分布有5類14-3-3蛋白同工型[20]。同工型ε和μ在淀粉顆粒中有分布[21]。

4 14-3-3蛋白在植物糖代謝中的作用

Sehnke等[21]通過在擬南芥中反義抑制14-3-3蛋白同工型GF14ε和GF14μ，發(fā)現(xiàn)與野生型比較，反義植株葉片中淀粉總含量增加近2倍，可萃取的淀粉含量提高近4倍，碘染后淀粉顆粒中碘-淀粉復(fù)合體的吸收光譜表明，反義植株來源的碘-淀粉復(fù)合體吸收光譜較野生型來源的向藍(lán)光波長移動(dòng)，說明反義植株中支鏈淀粉含量增加，對兩種來源的淀粉的可糊化程度的分析也支持了這一論斷。經(jīng)測定，在反義植株中淀粉的降解速度為1.3～1.5mg·g-1·h-1，而在野生型中淀粉降解速度約為1mg·g-1·h-1（濕重），說明前者的淀粉降解途徑完全啟動(dòng)，而負(fù)調(diào)控的減少時(shí)其淀粉含量的增加，進(jìn)一步說明14-3-3蛋白在淀粉代謝中起抑制作用，通常關(guān)閉淀粉的合成[21]。

體外試驗(yàn)結(jié)果表明，SPS的活性在很大程度上受到14-3-3蛋白的控制[7,12]。在Szopa J等[11]的試驗(yàn)中，通過反義抑制考察了馬鈴薯14-3-3蛋白同工型20r和29g在糖代謝中的作用，結(jié)果表明，葉片中焦磷酸蔗糖合成酶SPS的活性在所有轉(zhuǎn)基因植株中都顯著升高，但是蔗糖含量并沒有相應(yīng)的上升，推測可能是由于增加的蔗糖迅速地被用于多種代謝途徑中碳骨架的合成。在另一個(gè)試驗(yàn)中，結(jié)果有所差異，在SPS活性最高的系列中蔗糖含量比對照增加了近4倍，而其余的轉(zhuǎn)基因植株中蔗糖含量與對照差異不大，分析認(rèn)為，14-3-3蛋白的總量對酶的活性的控制作用比單獨(dú)某一個(gè)同工型的作用更加重要[12]。何天久等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)Sb14-3-3干涉載體馬鈴薯塊莖貯藏過程中，還原糖積累速率隨目的基因表達(dá)量的降低而減慢，與該過程伴隨發(fā)生的是蔗糖積累的同時(shí)減慢，推測Sb14-3-3可能參與馬鈴薯塊莖低溫糖化調(diào)節(jié)途徑。

Szopa等[9，11]的試驗(yàn)中還觀察到 α-酮戊二酸含量的上升，以及與之相關(guān)聯(lián)的谷氨酸/焦磷酸谷氨酸含量的增加，同時(shí)葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸的含量都顯著上升，表明在反義植株中糖酵解與TCA循環(huán)之間生化途徑的活化。

通過對參與TCA循環(huán)的各種酶在反義抑制20r和29g馬鈴薯植株中活性檢測發(fā)現(xiàn)，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPcase和檸檬酸合成酶的活性顯著上升，而丙酮酸激酶的活性上升并不顯著，檢測還發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖中天冬氨酸/天冬酰胺和谷氨酸－焦谷氨酸/谷氨酰胺的含量上升，可能是由于檸檬酸和蘋果酸含量上升對下游代謝的刺激造成的[7]。

馬鈴薯塊莖中，SPS的活性在反義抑制20r和29g的植株中也顯著上升，而當(dāng)反義抑制20r或者同時(shí)抑制20r和29g時(shí)，葡萄糖和淀粉的含量增加，而焦磷酸葡萄糖和果糖的含量在分別抑制20r和29g時(shí)并不受影響，在同時(shí)抑制兩者時(shí)下降，說明14-3-3蛋白對葉片和塊莖中SPS的活化途徑不同。

在反義抑制14-3-3蛋白的植株中，塊莖、葉片中淀粉含量普遍升高[7,11,12,21]，因此推測淀粉合成的關(guān)鍵酶SuSy活性受到14-3-3蛋白的的調(diào)控，但是檢測結(jié)果表明，塊莖中SuSy活性僅有極小幅度的上升，同時(shí)體外試驗(yàn)也說明14-3-3蛋白對SuSy活性沒有影響，另外兩個(gè)糖代謝中的重要酶AGPase和UGPase的活性也沒有受到影響，因此，塊莖中淀粉含量的上升可能是由于SPS的活性升高所致[12]。

免疫電鏡技術(shù)檢測表明，野生型擬南芥葉綠體淀粉顆粒密布有非ε類的14-3-3蛋白同工型，而ε類的14-3-3蛋白同工型分布較為稀少，說明除同工型ε和μ外，非ε類的14-3-3蛋白可能與淀粉合成有關(guān)（尚無相關(guān)的數(shù)據(jù)可以證明），這些同工型之間的關(guān)系以及14-3-3蛋白活化時(shí)是同源還是異源二聚體等問題都尚待研究。通過分析商品化的玉米來源的淀粉也含有14-3-3蛋白，說明其對淀粉合成的調(diào)節(jié)作用也存在于擬南芥以外的其他作物以及葉綠體以外的其他質(zhì)體中[21]。

通過對已知的淀粉合成相關(guān)酶類序列中14-3-3蛋白結(jié)合序列的調(diào)查，SSⅢ家族極有可能是其在葉綠體中的靶蛋白[21]。值得注意的是，SSⅢ蛋白與支鏈淀粉的合成直接相關(guān)，且對其他的SS同工型有顯著的控制作用。

與參與糖代謝的其他物質(zhì)不同，淀粉在所有的14-3-3蛋白抑制表達(dá)植株中，含量幾乎都表現(xiàn)為上升[7,11,12,21]，雖然這其中不能排除SPS的活性上升的作用，但是至少還有兩種因素需要考慮，第一，研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白可以影響馬鈴薯體內(nèi)的兒茶酚胺的含量，并進(jìn)而改變可溶性糖與淀粉的比例；第二，在擬南芥中檢測到14-3-3蛋白與淀粉磷酸化酶之間的直接反應(yīng)對淀粉合成有影響。因此，有至少兩條可能增加淀粉合成的途徑是對14-3-3蛋白依賴而對SPS不依賴的[12]。

5 展望

14-3-3蛋白表達(dá)廣泛，功能復(fù)雜，引人矚目，已有200多種蛋白質(zhì)被證明可以在體內(nèi)與它相互作用，其中包括各種蛋白激酶、受體、支架蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和凋亡調(diào)控蛋白、線粒體、葉綠體前體蛋白等[23]。14-3-3蛋白參與植物中很多生理過程調(diào)控，如參與植物對各種疾病和環(huán)境脅迫的應(yīng)答，在抵御疾病和抗脅迫中起重要作用；14-3-3蛋白通過對蔗糖磷酸合成酶活性的調(diào)節(jié)從而控制植物碳氮代謝來改變植物吸收氮營養(yǎng)的能力[24,25]。14-3-3蛋白調(diào)節(jié)植物糖代謝的關(guān)鍵酶活性，研究其在植物糖代謝中的作用，來提高作物產(chǎn)量和改良作物品質(zhì)具有重要的理論和實(shí)際意義。

[1]Moore B,Perez V.Specific acidic proteins of the nervous system[J].Physiological and Biochemical Aspects of Nervous Integration,1967:343-359.

[2]Ferl R,Manak M,Reyes M.The 14-3-3s[J].Genome Biology,2002,3(7):3010.1-3010.7.

[3]DeLille JM,Sehnke PC,Ferl R J.The arabidopsis 14-3-3 family of signaling regulators[J].Plant Physiology,2001(126):35-38.

[4]Dougherty M K,Morrison D K.Unlocking the code of 14-3-3[J].JCell Sci,2004(117):1 875-1 884.

[5]Obsil T,Ghirlando R,Klein D C,et al.Crystal structure of the 14-3-3ζ:serotonin N-acetyltransferase complex:a role for scaffolding in enzyme regulation[J].Cell,2001(105):257-267.

[6]Muslin A J,Tanner JW,Allen P M,et al.Interaction of 14-3-3 with signaling proteins ismediated by the recognition of phosphoserine[J].Cell,1996(84):889-897.

[7]Jan S,MagdalenaW,Iwona M,et al.Themetablic profile of the 14-3-3 repressed transgenic potato tubers[J].Plant science,2001(161):1 075-1 082.

[8]Petosa C,Masters S,Bankston L,et al.Liddington RC:14-3-3 zeta binds a phosphorylated Raf peptide and an unphosphorylated peptide via its conserved amphipathic groove[J].JBiol Chem,1998(273):16 305-16 310.

[9]Szopa J,Lukaszewicz M,Aksamit A,etal.Structural organisation,expression,and promoter analysis of a 16R isoform of 14-3-3 protein gene from potato[J].Plant Physiology and Biochemistry,2003(41):417-423.

[10]Wilczynski G,Kulma A,Szopa A.The expression of 14-3-3 isoforms in potato is developmentally regulated[J].J Plant Physiol,1998(153):118-126.

[11]Szopa J.Transgenic 14-3-3 isoforms in plants:the metabolite profiling of repressed 14-3-3 protein synthesis potato plants[J].Biochemical Society Transactions,2002(30):406-410.

[12]Magdalena Z,Jacek S,Jadwiga B,et al.Repression of six 14-3-3 protein isoforms resulting in the activation of nitrate and carbon fixation key enzymes from transgenic potato plants[J].Plant Science,2003(165):731-741.

[13]Yanagisawa S D.DNA-binding domains of plant transcriptionfactors contribute to multiple protein-protein interactions[J].Eur JBiochem,1997(250):403-410.

[14]Kawagoe Y,Campell B R,Murai N.Synergism between CACGTG(G-box)and CACCTG cis-elements is required for activation of the bean seed storage proteinβ-phaseolin gen[J].Plant J,1994(5):885-890.

[15]Bate N,Twell D.Functional architecture of a late pollen promoter:Pollen-specific transcription is developmentally regulated by multiple stage-specific and co-dependent activatorele ments[J].PlantMol Biol,1998,37(5):859-869.[16]Kim S Y,Wu R.Multiple protein factors bind to a rice glutelin promoter region[J].Nucleic Acids Research,1990,18(23):6 845-6 852.

[17]Lessard PA,Allen R D,Bernier F,et al.Multiple nuclear factors interact with upstream sequences of differentially regulatedβ-conglycinin genes[J].Plant Mol Biol,1991(16):397-413.

[18]Gasser SM,Amati B B,Cardenas M E,et al.Studies on scaffold attachment sites and their relation to genome function[J].Int Rev Cytol,1989,119:57-69.

[19]Sehnke P C,DeLille JM,Ferl R J.Consummating signal transduction the role of 14-3-3 proteins in the completion of signal-induced transitions in protein activity[J].The Plant Cell Online,2002(14):339-354.

[20]Bihn E A,Paul A L,Wang SW,et al.Localization of 14-3-3 proteins in the nuclei of arabidopsis and maize[J].Plant J,1997(12):1 439-1 445.

[21]Sehnke PC,Chung H J,Wu K,et al.Regulation of starch accumulation by granule-associated plant 14-3-3 proteins[J].Proc Natl Acad SciUSA,2001(98):765-770.

[22]何天久.SbTRXh1和Sb14-3-3基因?qū)︸R鈴薯塊莖低溫糖化的作用[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[23]苑存忠，楊蕾蕾，騰艷，等.14-3-3蛋白在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的作用[J].生物技術(shù)通訊，2007，18（5）：815-819.

[24]崔娜，李天來，李悅.植物中14-3-3蛋白的主要功能[J].生物技術(shù)，2007，17（2）：86-89.

[25]劉凡，李美，徐碧玉.植物14-3-3蛋白的功能及在作物遺傳育種中的應(yīng)用展望[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，39（3）：273-278.