核遷移試驗(yàn)在香菇交配型分析中的應(yīng)用

李安政,林芳燦

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所，湖北 武漢 430065;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 應(yīng)用真菌研究所，湖北 武漢 430070 )

核遷移試驗(yàn)在香菇交配型分析中的應(yīng)用

李安政1,林芳燦2

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所，湖北 武漢 430065;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 應(yīng)用真菌研究所，湖北 武漢 430070 )

在四極性的擔(dān)子菌香菇中，由于沒(méi)有明確的形態(tài)差異，交配型分析中兩種不親和反應(yīng)即A=B≠和A≠B=，難以相互區(qū)別.在利用原生質(zhì)體單核化對(duì)5個(gè)供試香菇菌株進(jìn)行常規(guī)交配型分析的基礎(chǔ)上，采用核遷移試驗(yàn)對(duì)各菌株孢子單核體的交配型組合進(jìn)行了鑒定.結(jié)果表明，5個(gè)菌株中有4個(gè)菌株觀察到核遷移現(xiàn)象，核遷移僅出現(xiàn)于A=B≠反應(yīng)中而不出現(xiàn)于A≠B=反應(yīng)中.總的說(shuō)來(lái)，由于該方法通?？汕宄^(qū)分A=B≠和A≠B=反應(yīng)，因此，用于香菇交配型因子的準(zhǔn)確鑒定是行之有效的.

香菇；交配型；核遷移試驗(yàn)；標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株

香菇(Lentinulaedodes)是一種食藥用真菌，也是世界三大栽培蕈菌之一[1].作為一種異宗結(jié)合的四極性擔(dān)子菌，香菇的交配系統(tǒng)由兩個(gè)非連鎖的A、B交配型因子所控制，它們的子實(shí)體產(chǎn)生4種交配型 (AxBx,AyBy,AyBx,AxBy)的有性孢子；只有兩對(duì)因子均不相同的組合即AxBx+AyBy或AyBx+AxBy，才能正常結(jié)實(shí)并完成整個(gè)有性生活史[1-2].

在四極性擔(dān)子菌交配型分析的常規(guī)程序中，要點(diǎn)是要從供試單孢中找到代表四種交配型的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株(T1、T2、T3和T4)[3-4]，因而通常需要隨機(jī)挑選一定數(shù)量的單孢(如20個(gè)以上)進(jìn)行兩兩配對(duì)[5]，工作量較大.原生質(zhì)體單核化技術(shù)[6]的出現(xiàn)，為交配型的鑒定提供了更可靠而簡(jiǎn)便的方法：標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株T1、T2，可以直接利用該技術(shù)從供試單孢的親本雙核體獲得.

通過(guò)交配型分析的常規(guī)程序，可以明確的是T1和T2之間、T3和T4之間均是A≠B≠；而對(duì)T1與T3、T1和T4、T2與T3、T2和T4間的關(guān)系，只可能知道有一個(gè)交配型因子相同，具體是哪個(gè)交配型因子相同卻難以區(qū)分.為進(jìn)行交配型因子的深入研究，或在分子生物學(xué)研究中要建立不同交配型的基因池時(shí)，需要對(duì)四種類(lèi)型的擔(dān)孢子的交配型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定.

已知四極性蕈菌的B交配型因子控制核遷移[6-7]，即只有當(dāng)B座位處于異等位基因狀態(tài)時(shí)(A≠B≠、A=B≠)，核遷移過(guò)程才會(huì)發(fā)生.可以根據(jù)此特點(diǎn)，利用核遷移試驗(yàn)來(lái)區(qū)分A=B≠和A≠B=，從而對(duì)交配型進(jìn)行準(zhǔn)備鑒定.

本研究將在利用原生質(zhì)體單核化方法對(duì)香菇進(jìn)行交配型的常規(guī)分析基礎(chǔ)上，試用核遷移試驗(yàn)對(duì)4種單孢的交配型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，為深入研究香菇的交配型因子的結(jié)構(gòu)等方面奠定初步的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

供試香菇野生菌株GAN057、SHX041由野外環(huán)境采集；栽培菌株IB15、IB31由河南省科學(xué)院生物研究所提供，栽培菌株HL01由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種廠提供；培養(yǎng)基：PDA(馬鈴薯，葡萄糖)；CYM(磷酸鹽，硫酸鎂，葡萄糖，酵母膏和蛋白胨)；MYG(麥芽糖，酵母膏，葡萄糖)；木屑代料培養(yǎng)基，木屑培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[8-9]所述的方法進(jìn)行.

1.2 雙核菌株的栽培、擔(dān)孢子的收集及孢子單核體的制備

6月中旬，以玻璃瓶裝入木屑代料培養(yǎng)基，高壓滅菌2 h，冷卻后接種，參照文獻(xiàn)[9]所述方法栽培后收獲子實(shí)體，進(jìn)行孢子的收集和孢子單核體的制備[9].

1.3 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株T1、T2、T3和T4的確定

用原生質(zhì)體單核化方法對(duì)雙核菌絲體進(jìn)行原生質(zhì)體的制備[4]，將所得的原生質(zhì)體再生菌株兩兩配對(duì)，以鎖狀聯(lián)合的有無(wú)作為親和與否的標(biāo)準(zhǔn)，選出一對(duì)可親和的單核化菌株，分別命名為T(mén)1、T2，即為所需的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株T1、T2.

將上述標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株T1、T2與相應(yīng)的孢子單核體進(jìn)行配對(duì)，從與T1、T2都不親和的配對(duì)中選出部分孢子單核體進(jìn)行兩兩配對(duì)，再?gòu)倪@些配對(duì)中選出一對(duì)可親和的孢子單核體，分別命名為T(mén)3、T4，即為所需的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株T3、T4.

圖1 核遷移試驗(yàn)示意圖Fig.1 Representation of testing for nuclear migration

1.4 單核體交配型的鑒定

課堂是學(xué)生求知、創(chuàng)新、展示自我、體驗(yàn)成功的平臺(tái)。激勵(lì)機(jī)制是學(xué)生發(fā)展的動(dòng)力，在課堂中，學(xué)生時(shí)常會(huì)提出一些新穎的看法，獨(dú)到的見(jiàn)解，對(duì)于那些發(fā)表不同想法的同學(xué)也應(yīng)加以表?yè)P(yáng)，給予鼓勵(lì)，提升他們的信心，給學(xué)生以無(wú)限的思維空間。一個(gè)人總是會(huì)跌倒的，但關(guān)鍵是要鼓勵(lì)他能夠迅速爬起來(lái),這種激勵(lì)不是針對(duì)一部分人，而是對(duì)所有的學(xué)生。通過(guò)導(dǎo)語(yǔ)激勵(lì)，目標(biāo)激勵(lì)，創(chuàng)新激勵(lì)和評(píng)價(jià)激勵(lì)等，慢慢消除職高學(xué)生的自卑心理，幫助他們樹(shù)立信心，學(xué)生才會(huì)感動(dòng)。

用四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株T1、T2、T3和T4與所有的孢子單核體進(jìn)行配對(duì)，鏡檢配對(duì)菌絲鎖狀聯(lián)合的有無(wú).根據(jù)反應(yīng)情況確定孢子單核體的交配型.

1.5 核遷移試驗(yàn)準(zhǔn)確鑒定交配型

將四組單孢菌株T1、T2、T3和T4每組取數(shù)個(gè)單核體進(jìn)行核遷移實(shí)驗(yàn).第一次配對(duì)組合有T1×T3、T1×T4、T2×T3和T2×T4等4種組合.兩配對(duì)塊之間相距約2 cm，培養(yǎng)至菌絲交接后，在配對(duì)塊外側(cè)各取一菌塊分別按圖1所示與相應(yīng)單核體進(jìn)行第二次配對(duì).鏡檢第二次配對(duì)后有無(wú)形成鎖狀聯(lián)合，以判斷有無(wú)核遷移現(xiàn)象的發(fā)生.凡第二次配對(duì)產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合，表明相應(yīng)的第一次配對(duì)有核遷移發(fā)生，其交配反應(yīng)為A=B≠；凡第二次配對(duì)無(wú)鎖狀聯(lián)合產(chǎn)生，表明相應(yīng)的第一次配對(duì)無(wú)核遷移發(fā)生，其交配反應(yīng)為A≠B=.據(jù)此即可確定T1與T3之間交配型關(guān)系到底是A=B≠還是A≠B=；對(duì)應(yīng)的，T1與T4之間、T2與T3之間、T2與T4之間的關(guān)系也可以鑒定出來(lái).

2 結(jié)果與分析

2.1原生質(zhì)體單核體的鑒定及標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株T1、T2的確定

對(duì)5個(gè)供試雙核菌株，先對(duì)相應(yīng)的子實(shí)體進(jìn)行組織分離培養(yǎng)后得到菌絲，再對(duì)菌絲進(jìn)行原生質(zhì)體單核化.酶解涂平板后置25℃培養(yǎng)，5 d左右即出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的白色再生菌落.挑取其中直徑較小的菌落(生長(zhǎng)相對(duì)慢，是單核的可能性較大)至PDA試管斜面中繼續(xù)培養(yǎng)，每天挑取一次，連續(xù)挑取(約7 d左右)至平板長(zhǎng)滿菌絲不能再挑取為止.

對(duì)初步挑取到試管斜面的再生菌落菌絲經(jīng)鏡檢，無(wú)鎖狀聯(lián)合的確定為單核體，最終每個(gè)雙核菌株獲得的原生質(zhì)體再生單核體數(shù)量在54～80之間.交配型鑒定結(jié)果表明，屬于每種雙核菌株的原生質(zhì)體再生單核體均可獲得兩種交配型(表1).將兩種交配型的單核體中一種命名為T(mén)1，一種命名為T(mén)2；指定T1的交配型為AxBx，則T2的交配可定為AyBy.T1、T2即為需的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株.

表1 5個(gè)雙核菌株獲得的原生質(zhì)體單核體比例Tab.1 Ratio of protoplast monokaryons from 5 dikaryon strains

表2 4種類(lèi)型單孢交配型鑒定結(jié)果

2.2標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株T3、T4的確定及孢子單核體交配型常規(guī)分析

每個(gè)雙核菌株后代單孢與相應(yīng)的四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株進(jìn)行交配鑒定，將配對(duì)反應(yīng)中僅分別與T2、T1、T4和T3親和的單孢分別歸為T(mén)1組、T2組、T3組和T4組，從而將相應(yīng)的單孢分為四種類(lèi)型.其中T1組、T2組的交配型分別為AxBx、AyBy；指定T3組的交配型為AxBy，則T4組的交配型為AyBx.

2.3四類(lèi)孢子單核體菌株交配型的準(zhǔn)確鑒定

2.3.1 核遷移試驗(yàn)與交配型的準(zhǔn)確鑒定 5個(gè)供試香菇菌株中，初始指定T1、T2的交配型分別為AxBx、AyBy；T3的交配型為AxBy、T4的交配型為AyBx.經(jīng)核遷移試驗(yàn)，確定了2株(IB15,SHX041)的交配型與初始指定的一致，即T1、T2、T3和T4的交配型分別為AxBx、AyBy、AxBy和AyBx；確定了2株(IB31，GAN057)的T3、T4交配型分別為AyBx、AxBy，與初始的指定剛好相反.較特殊的是HL01，在其核遷移試驗(yàn)中未獲得預(yù)期結(jié)果，第二次配對(duì)中所有的配對(duì)組合均未發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合.

2.3.2 交配型鑒定結(jié)果 通過(guò)核遷移試驗(yàn)，最終鑒定出了各組單核體的準(zhǔn)確的交配型(表2).對(duì)HL01菌株，用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法[10]鑒定T1、T2、T3和T4的交配型分別為A1B1、A2B2、A2B1，和A1B2.

3 討論

核遷移試驗(yàn)的理論基礎(chǔ)在于B因子的特定功能.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正如真菌遺傳學(xué)所預(yù)期的那樣，在四極性異宗結(jié)合菌中，只有A≠B≠或A=B≠即B因子不相同的配對(duì)才會(huì)發(fā)生核遷移.因此兩個(gè)交配結(jié)果同為不親和的配對(duì)，根據(jù)第二次配對(duì)鎖狀聯(lián)合的有無(wú)即核遷移是否發(fā)生，可以對(duì)二者哪一個(gè)是A=B≠，哪一個(gè)是A≠B=，作出清楚的判別.值得注意的是，在供試5個(gè)菌株的核遷移試驗(yàn)中，HL01菌株的結(jié)果出現(xiàn)異常，其第二次配對(duì)中所有的配對(duì)組合均未出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合.這是因?yàn)樵摼暝诋惡嘶牟课?、范圍、穩(wěn)定性等方面屬不規(guī)則類(lèi)型[11]，還是有其他未知因素妨礙了鑒定的正常進(jìn)行，有待進(jìn)一步研究.

在擔(dān)子菌的交配型分析中，最可靠的方法是兩兩配對(duì)法.但在樣本容量很大時(shí)該方法的工作量也顯著增大.如本研究中HL01的189個(gè)后代單孢菌株如按此方法進(jìn)行交配型的鑒定需C1892=17766個(gè)配對(duì).而用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株法，理論上只需189×4=756個(gè)配對(duì)，極大的減少了鑒定工作量.標(biāo)準(zhǔn)菌株法的至關(guān)重要的一點(diǎn)是要求四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株絕對(duì)準(zhǔn)確、可靠.采用原生質(zhì)體單核化的方法，可以準(zhǔn)確獲得與親本雙核體交配型相同的T1(A1B1)、T2(A2B2)兩種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)交菌株.

在香菇中，由于沒(méi)有明確的形態(tài)差異，兩種不親和反應(yīng)即A=B≠和A≠B=，難以相互區(qū)別.在對(duì)四極性蕈菌常規(guī)交配型分析過(guò)程，測(cè)交菌株T3的選擇是隨機(jī)的，其交配型既有可能是AxBy也有可能是AyBx[4].在對(duì)大量單核體的交配型因子進(jìn)行鑒定時(shí)，勢(shì)必會(huì)遇到各種不親和反應(yīng)彼此難以區(qū)分的問(wèn)題.此時(shí)，在常規(guī)交配型分析的基礎(chǔ)上，增用核遷移試驗(yàn)進(jìn)行深入研究，對(duì)提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，將大有助益.除了在遇到在發(fā)生部位、范圍等方面不太規(guī)則的核遷移時(shí)應(yīng)注意對(duì)結(jié)果進(jìn)行審慎的分析和驗(yàn)證之外，總的來(lái)說(shuō)，在交配型因子鑒定中，核遷移試驗(yàn)不失為一種更便捷而準(zhǔn)確的研究手段.

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TheMatingTypeAnalysisinLentinulaEdodesUsingNuclearMigrationTest

LI An-zheng1,LIN Fang-can2

(1.Institute of Medical Biotechnology, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2.Institute of Applied Mycology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

During the mating type analysis of the tetrapolar basidiomycetesLentinulaedodes, It is difficult to distinguish mating reactons betweenA=B≠ andA≠B= due to the lack of definite morphological differences. In this study, based on the regular mating type analysis of 5L.edodesstrains by means of protoplasting monokaryotization, the nuclear migration test was used for identification of mating type factors of monkaryons derived from each of these strains. The result showed that, using this method, 4 out of the 5L.edodesstrains occurred nuclear migration. The nuclear migration occurred only inA=B≠ but not inA≠B=.Therefore the nuclear migration test can usually discriminate definitely mating reactions betweenA=B≠ andA≠B=, and it is a effective method for exactly identification of mating type factors ofL.edodes.

Lentinulaedodes; tetrapolar; mating type analysis; standard tester strain

2013-08-29.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30170024).

李安政(1972- )，男，博士，講師，主要從事蕈菌遺傳及生物技術(shù)研究.

S646.1+2；Q344+

：A

1008-8423(2013)03-0289-03