響應(yīng)面分析法優(yōu)化交沙霉素發(fā)酵培養(yǎng)基

胡 平，林開春

(1.恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，湖北 恩施 445000； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化交沙霉素發(fā)酵培養(yǎng)基

胡 平1，2，林開春2*

(1.恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，湖北 恩施 445000； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

以交沙霉素產(chǎn)生菌R29為供試菌株，采用響應(yīng)面法綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用SAS分析軟件對(duì)交沙霉素發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果表明：棉籽餅粉和豆油為主效應(yīng)因素，且培養(yǎng)基中棉籽餅粉和豆油最佳比例分別為1.9%和0.405%時(shí)，預(yù)測(cè)交沙霉素的發(fā)酵效價(jià)為220.6 μg/mL.經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，最優(yōu)條件下交沙霉素的發(fā)酵效價(jià)為221.8 μg/mL，與預(yù)測(cè)值相近，比原始配方下交沙霉素的發(fā)酵效價(jià)提高了10.66%.說明優(yōu)化的發(fā)酵配方確實(shí)比初始配方更有利于菌株R29的產(chǎn)素.

響應(yīng)面分析法；交沙霉素；發(fā)酵培養(yǎng)基

交沙霉素是那波鏈霉菌交沙霉素變種(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)產(chǎn)生的一種十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生藥物，于1964年由日本山之內(nèi)制藥株式會(huì)社研制而成，對(duì)葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎雙球菌和百日咳桿菌、梭狀芽胞桿菌、白喉?xiàng)U菌、炭疽桿菌、布氏桿菌、軍團(tuán)菌、螺旋桿菌、支原體、立克次體、衣原體、螺旋體等亦有較好抗菌作用[1]，臨床用于呼吸道感染、支氣管炎、肺炎、副鼻竇炎、中外耳炎、皮膚感染、術(shù)后創(chuàng)口感染、泌尿科、五官科、口腔科感染等，療效確切.自誕生以來，它就在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于臨床了[2-3].但是在國內(nèi)的應(yīng)用僅處于起步階段，目前尚無廠家生產(chǎn)原藥，具有相當(dāng)大的研發(fā)潛能.為盡快實(shí)現(xiàn)交沙霉素原料藥的國產(chǎn)化，首先要提高交沙霉素產(chǎn)生菌的產(chǎn)素能力，而優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一.近年來，國內(nèi)外很多研究人員利用響應(yīng)面分析法(Response Surface Analysis，RSA)在培養(yǎng)基優(yōu)化方面取得了良好的效果[4-6].筆者以本實(shí)驗(yàn)室的交沙霉素產(chǎn)生菌R29為供試菌株，采用響應(yīng)面法綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用SAS分析軟件對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，為該菌的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供現(xiàn)實(shí)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌種

交沙霉素產(chǎn)生菌那波鏈霉菌交沙霉素變種(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)R29菌株，由武漢天惠生物工程有限公司提供.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基 土豆泥10%,麥片2.5%,精氨酸0.02%,瓊脂2%,消前pH7.2～7.4.

1.2.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖1.0%,淀粉1.0%,黃豆餅粉1.5%,硫酸鎂0.05%,酵母粉0.5%,碳酸鈣0.3%,磷酸氫二鉀0.5%.消前pH8.0.

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖2.0%,棉籽餅粉2.0%,豆油1.0%,碳酸鈣0.3%,玉米淀粉4.0%,磷酸二氫鉀0.03%,面筋粉2.0%,硫酸鎂0.05%,氯化鈉0.1%,消前pH8.0.

1.3 菌種發(fā)酵

將保藏的斜面菌種用竹簽打塊接入種子培養(yǎng)基，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)34 h.將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量8%，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8 d.

1.4 交沙霉素檢測(cè)

采用高效液相色譜法(HPLC)：色譜柱為C18反向柱(填料Hypersil ODS 25 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫為室溫；流動(dòng)相為磷酸緩沖液(0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用1 mol/L的磷酸調(diào)節(jié)pH值為3)-甲醇(體積比為20∶80，pH 3)；流速為1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長為232 nm；進(jìn)樣量為10 μL；交沙霉素參考品為杭州民生藥業(yè)生產(chǎn)的交沙霉素糖衣片，含量200 mg/片.

表1 試驗(yàn)因素編碼水平及結(jié)果

1.5 優(yōu)化設(shè)計(jì)方法

1.5.1 Placket-burman (PB)設(shè)計(jì) 采用PB設(shè)計(jì)的兩水平法對(duì)交沙霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基的9種成分進(jìn)行試驗(yàn)，篩選交沙霉素發(fā)酵的主效應(yīng)因素.

1.5.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)方法1.5.1中得出的一次擬和方程設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn).方程中變量的系數(shù)如果為正，則該水平應(yīng)設(shè)計(jì)為遞增，反之遞減；變量系數(shù)的大小決定變化幅度，系數(shù)越大，變化的幅度越小，反之越大.

1.5.3 Box-wilson中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析 以方法1.5.2中得到的中心點(diǎn)，根據(jù)Box-wilson中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn).根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行回歸擬合，得到模型方程，根據(jù)所得模型的響應(yīng)面分析立體圖，結(jié)合回歸方程，求得模型極值點(diǎn)，該點(diǎn)代表的主效應(yīng)因子數(shù)據(jù)即為預(yù)測(cè)的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方比例值.

1.5.4 驗(yàn)證性試驗(yàn) 分別在預(yù)測(cè)最優(yōu)發(fā)酵條件和初始條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，重復(fù)5次，根據(jù)交沙霉素在預(yù)測(cè)最優(yōu)發(fā)酵條件下的實(shí)際平均效價(jià)值，與初始條件下的結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證該模型的預(yù)見是否準(zhǔn)確，從而確定交沙霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方.

2 結(jié)果與分析

2.1 PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

以R29為供試菌株進(jìn)行PB設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1、表2.表1中棉籽餅粉和豆油的Pr>|t|分別為0.034和0.022，即表示這兩個(gè)因素在95%的置信區(qū)間顯著.

用SAS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到一次回歸方程：

Y=427-32.0A+6.17B-7.00C-2.17D-40.2E+4.17F+4.83G-1.67H-2.50J.

經(jīng)過回歸數(shù)據(jù)分析，R-Sq=97.5%，R-Sq(adj)=86.1%，系數(shù)數(shù)值大，表明擬合良好，P=0.048，小于0.05，表明回歸方程擬合良好.

根據(jù)表1中t-檢驗(yàn)結(jié)果可知，棉籽餅粉和豆油為重要因素，在95%置信區(qū)間其可信度分別為96.6%和97.8%，可考慮作為主效應(yīng)因子進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗(yàn).

表2 Placket-burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表4 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)變量及水平

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

圖1 響應(yīng)面立體分析圖Fig.1 The graph of response surface analysis

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果可知棉籽餅粉和豆油為重要因素，而葡萄糖、碳酸鈣、玉米淀粉、磷酸二氫鉀、面筋粉、氯化鈉和硫酸鎂均對(duì)交沙霉素的產(chǎn)出無顯著影響，這些因素保持原始水平不變.根據(jù)PB試驗(yàn)得出的一次擬和方程對(duì)棉籽餅粉和豆油進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示.可知最優(yōu)條件在處理6和處理7之間，故采用1.9%棉籽餅粉，0.4%豆油為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn).

2.3 中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

保持發(fā)酵培養(yǎng)基配方中除棉籽餅粉和豆油以外的其它6個(gè)因素水平不變，以中心點(diǎn)(棉籽餅粉1.9%，豆油0.4%)，對(duì)棉籽餅粉和豆油兩個(gè)因素進(jìn)行中心試驗(yàn)組合設(shè)計(jì).中心點(diǎn)重復(fù)5次，保證擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5.

將相應(yīng)面中得到的數(shù)據(jù)，利用SAS軟件回歸擬合，得到交沙霉素效價(jià)的二次經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑椋篩=546.80+3.81A+7.21B-95.34A2-85.34E2+11.75AE；同時(shí)得到響應(yīng)面分析立體圖見圖1，從圖1可以看出，棉籽餅粉和豆油對(duì)交沙霉素產(chǎn)出的效應(yīng)存在著一定的交互作用.對(duì)Y進(jìn)行回歸系數(shù)評(píng)估，結(jié)果表明A2和E2在大于F值的概率(Pr>F)分別為0.001、0.002，即A2和E2為顯著影響項(xiàng)；變異系數(shù)的分析表明，2次項(xiàng)影響在大于F值的概率(Pr>F)為0.001，即2次項(xiàng)影響為顯著影響項(xiàng)；方差分析數(shù)據(jù)表明在大于F值的概率(Pr>F)為0.005，說明回歸方程有很高的可靠性和顯著性；且擬合方程的決定系數(shù)R2值為0.959 9，表明該方程與實(shí)際有很好的擬合性，可用來進(jìn)行交沙霉素發(fā)酵效果的分析和預(yù)測(cè).根據(jù)回歸方程結(jié)合響應(yīng)面分析立體圖，求得模型極值點(diǎn)為A=0，E=0.05，對(duì)應(yīng)棉籽餅粉和豆油分別為1.9%和0.405%，此時(shí)預(yù)測(cè)交沙霉素的發(fā)酵效價(jià)為220.6 μg/mL.

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

選用菌株R29在預(yù)測(cè)最優(yōu)條件即和發(fā)酵初始條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，得到實(shí)際平均交沙霉素發(fā)酵效價(jià)分別為221.8 μg/mL和200.4 μg/mL，最優(yōu)條件下交沙霉素的發(fā)酵效價(jià)與預(yù)測(cè)值相近，說明該模型能準(zhǔn)確的預(yù)見交沙霉素的實(shí)際發(fā)酵效價(jià)，同時(shí)優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基配方下交沙霉素的發(fā)酵效價(jià)比原始配方下交沙霉素的發(fā)酵效價(jià)提高了10.66%，說明優(yōu)化的發(fā)酵配方確實(shí)比初始配方更有利于菌株R29的產(chǎn)素.

3 討論

通常發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法是采用單因素試驗(yàn)，但單因素試驗(yàn)因無法考察到各因素之間的交互影響而存在一定的局限性，因而該方法不是總能獲得最佳條件[7].此外，若考察的因素較多，則實(shí)驗(yàn)次數(shù)會(huì)較多，周期長，為了彌補(bǔ)單因素試驗(yàn)的缺陷，許多研究人員在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用了正交設(shè)計(jì)法[8-9]、二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)[10]、均勻設(shè)計(jì)法[11，12]、改進(jìn)單純形法[13-14]和響應(yīng)面分析[15]等方法進(jìn)行條件的優(yōu)化工作.本試驗(yàn)首次將PB設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析等方法運(yùn)用于交沙霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)中，并借助SAS統(tǒng)計(jì)軟件快捷可靠地獲得了較優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，取得了較好的效果.因此，采用相應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基是一種行之有效的實(shí)驗(yàn)方法，但此研究僅限于搖瓶發(fā)酵，仍需上罐分批發(fā)酵進(jìn)一步驗(yàn)證，而且，本試驗(yàn)并未對(duì)裝料量、通氣、起始pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)物、前體物質(zhì)和補(bǔ)料等其他的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行研究試驗(yàn)，對(duì)這些發(fā)酵條件尚需進(jìn)一步探索.

[1] Richard E R, Robert B, Lola W G,et al. In vitro susceptibility of common clinical anaerobic and aerobic isolates against josamycin[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1976, 9: 253-257.

[2] Kuniaki T, Yoshiya A, Shunji M,et al. Total synthesis of carbomycin B and josamycin (leucomycinA3)[J]. Tetrahedron letters, 1978, 21: 2837-2840.

[3] Burch D G S.The comparative efficacy of antimicrobials for the prevention and treatment of enzootic pneumonia and some of their pharmacokinetic/ pharmacodynamic relationships[J]. The Pig Journal, 2004, 53: 8-27.

[4] 熊志強(qiáng)，徐平，涂金國.利用響應(yīng)面法優(yōu)化紅谷霉素發(fā)酵培養(yǎng)基[J].微生物學(xué)報(bào)，2006，33(4)：5-9.

[5] 郝學(xué)財(cái)，余曉斌，劉志鈺，等.響應(yīng)面方法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā)，2006，27(1)：38-41.

[6] 董錫文，杜春梅，林建強(qiáng).曲音波響應(yīng)面法優(yōu)化斜臥青霉Ju-A10產(chǎn)CMCase的條件[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(3)：31-37.

[7] 褚以文.微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法及其OPTI優(yōu)化軟件[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，1999，20(2)：58-61.

[8] 李敏.褐環(huán)乳牛肝菌(Suillus luteus (L.：Fr.) Gray)發(fā)酵生物學(xué)的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[9] 周麗偉.羊肚菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及其多糖生物活性的研究[D].合肥：安徽大學(xué)，2007.

[10] 徐位力，蘇開君，王偉平，等.用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化馬占相思增殖培養(yǎng)基[J].廣東林業(yè)科技，2003，19(4)：13-16.

[11] 趙健，高曉丹，邱榮洲，等.應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化生防菌ZB-6發(fā)酵培養(yǎng)基組分及條件研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，22(4)：341-345.

[12] 胡旭曄，張琴，湖海峰，等.多殺菌素發(fā)酵工藝研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38(2)：90-93.

[13] 彭桂永，陳明久，卓寧化.地徑材積表編制方法的研究[J].林業(yè)勘察設(shè)計(jì)，2003(1)：1-3.

[14] 李湘，李忠.雙柱循環(huán)色譜分離過程的最優(yōu)化[J].化學(xué)工程，2003，31(1)：17-29.

[15] 常亞飛，陳守文，喻子牛.蘇云金素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計(jì)[J].中國生物防治，2006，22(3)：190-194.

OptimizationofFermentationMediumforJosamycinUsingResponseSurfaceAnalysis

HU Ping1，2，LIN Kai-chun2*

(1.Department of Biological Engineering，Enshi Technical College，Enshi 445000，China； 2.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070，China)

Experiments were designed to optimize the fermentation medium of josamycin R29 by the response surface analysis, using SAS analysis software to optimize.The results showed that the main effect factors were cottonseed cake powder and soybean oil,and the fermentation titer of josamycin was expected to be 220.6 μg/mL when the proportion of cottonseed cake powder and soybean oil was 1.9% and 0.405% respectively.And the validation test showed that,the josamycin fermentation titer was 221.8 μg/mL in the optimal conditions，similar to forecast,which was 10.66% higher than the initial medium components before optimization,showing that optimization of the fermentation medium does more than the original.

response surface analysis; josamycin; fermentation

2013-05-08.

武漢天惠生物工程有限公司自籌項(xiàng)目.

胡平(1981- )，女，講師，碩士，主要從事生物制藥技術(shù)的教學(xué)與研究；*

：林開春(1949- )，男，副教授，碩士，主要從事發(fā)酵工業(yè)方面的研究.

Q816；TQ92

A

1008-8423(2013)02-0138-04