響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵藤茶黃酮和多糖的提取工藝

肖 浩，鄭小江

(1.湖北省恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445000; 2.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵藤茶黃酮和多糖的提取工藝

肖 浩1,2，鄭小江2*

(1.湖北省恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445000; 2.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化藤茶黃酮和多糖的提取工藝.結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為提取溫度96℃，時(shí)間1.6 h，料液比1∶21.在此優(yōu)化工藝條件下，總黃酮和多糖的提取得率分別為22.94%和2.13%.藤茶黃酮和多糖的優(yōu)化提取工藝有利于藤茶資源的綜合開發(fā)利用.

發(fā)酵藤茶；黃酮；多糖；響應(yīng)面；優(yōu)化提取

藤茶為葡萄科(Vitaceae)蛇葡萄屬(AmpelopsisMichaux)顯齒蛇葡萄，學(xué)名為Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz) W.T. Wang，是一種野生木質(zhì)攀援藤本植物，俗稱山甜茶、白茶、甘露茶、白毛猴、龍須茶、茅巖莓茶等，主要分布于我國長(zhǎng)江流域的湖南、湖北、云南、貴州、廣東、廣西、福建等地[1-4].研究表明，藤茶中含有黃酮、多糖、多酚、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種活性成分，其中最主要的活性成分是以二氫楊梅素為主的黃酮類物質(zhì)[5-7].經(jīng)大量藥理學(xué)試驗(yàn)證明，二氫楊梅素具有消炎鎮(zhèn)痛、祛痰止咳、降血脂、抗氧化、保肝護(hù)肝、增強(qiáng)免疫力、抗癌等藥理功效[8-16].同時(shí)藤茶多糖也具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等功能，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值[17-19].近年來，已有許多學(xué)者開展了從藤茶中提取黃酮和多糖的研究，通常是以有機(jī)溶劑提取藤茶黃酮，如乙醇、甲醇等[20].這種方法提取成本高，回收溶劑的能耗高，還存在費(fèi)時(shí)、重現(xiàn)性差、對(duì)設(shè)備要求高等不足之處.而且所用溶劑通常有毒或易燃易爆，易對(duì)環(huán)境和操作人員造成危害.超臨界萃取藤茶黃酮雖具有節(jié)省試劑，無污染等優(yōu)點(diǎn)，但為了獲得超臨界條件，設(shè)備一次性投資較大，運(yùn)行成本高，回收率較差.此外，還有大孔樹脂吸附法、微波萃取法、逆流法、超聲波輔助溶劑提取法等[21-22]，均存在投資成本高、操作復(fù)雜等缺點(diǎn).本課題組通過對(duì)藤茶黃酮的研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素其中的主要成分，在熱水和冷水中的溶解度差別很大，因此可用熱水作為提取劑.同時(shí)，用熱水提取還可以增加藤茶多糖的溶出，同時(shí)得到黃酮和多糖，具有其他方法無法比擬的優(yōu)勢(shì).本文以發(fā)酵型藤茶加工后的邊角料為試驗(yàn)材料，采用熱水浸提法，優(yōu)化提取藤茶中的黃酮和多糖，然后分離純化，得到黃酮和多糖兩類活性成分.該方法工藝簡(jiǎn)單，成本低，提取得率較高，環(huán)保，適合工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，可為藤茶有效成分的綜合開發(fā)利用提供技術(shù)支持.

1 材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

“白露”發(fā)酵型藤茶加工后的邊角料，于60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎，過60目篩，石油醚脫脂，保存?zhèn)溆?

1.2 主要儀器與設(shè)備

2 試驗(yàn)方法

2.1 浸提指標(biāo)測(cè)定方法

2.1.1 總黃酮含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]：稱取二氫楊梅素對(duì)照品5 mg，置于50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至50 mL，配制成100 μg/mL的溶液.吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，在292 nm下測(cè)定吸收度，以對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.038 3x+0.009 1，R2=0.999 3.樣品測(cè)定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.1.2 多糖含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]：精密稱定干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品10 mg，用蒸餾水溶解并定容至100 mL容量瓶中，配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置10 mL具塞試管中，各加入蒸餾水補(bǔ)充至1 mL，加入0.2%硫酸-蒽酮試液4 mL搖勻，浸于冰水浴中冷卻，然后移至沸水浴中加熱10 min，取出用冷水冷卻至室溫，室溫放置10 min左右，于620 nm處測(cè)定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.031 7x-0.001 2，R2=0.999 3.樣品測(cè)定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.2 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取經(jīng)石油醚脫脂的藤茶葉粗粉1.0 g，加入一定量去離子水，在一定溫度下于水浴鍋內(nèi)提取一定時(shí)間，離心，將提取液用水定容至25 mL.然后從中分別取0.2 mL參與反應(yīng)，測(cè)定其中的黃酮含量.另外從中取5 mL于離心管中，加入4倍體積的無水乙醇，靜置過夜，離心，將沉淀用水溶解并定容至100 mL，從中取1 mL溶液參與反應(yīng)，測(cè)定其中的多糖含量.以不同的浸提溫度(55、65、75、85、95℃)、浸提時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)為單因素，考察各單因素對(duì)藤茶總黃酮和多糖提取得率的影響.

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法對(duì)浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比3個(gè)因素(分別以A、B、C代碼表示)的低、中、高三個(gè)試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行因素編碼，通過響應(yīng)面分析法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化.

UAV+RFID技術(shù)的三維路徑規(guī)劃模型如圖1所示，圖中以網(wǎng)格形式標(biāo)注出了UAV的空間任務(wù)、空間障礙物和RFID的感應(yīng)區(qū)域。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素浸提效果分析

3.1.1 浸提溫度對(duì)提取率的影響 設(shè)定料液比1∶20，提取時(shí)間為2 h，提取1次(下同)，不同浸提溫度下的總黃酮和多糖提取得率如圖1所示.隨著提取溫度的升高，總黃酮和多糖的提取得率逐漸增加.因提取的溫度越高，溶出的雜質(zhì)也越多，且85℃以上的高溫對(duì)藤茶黃酮的結(jié)構(gòu)和活性有一定的影響，綜合考慮提取成本及黃酮成分的穩(wěn)定性，選擇85℃為最合適提取溫度.

3.1.2 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響 設(shè)定料液比1∶20，提取溫度為85℃，不同浸提時(shí)間下的總黃酮和多糖提取得率如圖2所示.隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)而總黃酮與多糖含量增加，但增加的幅度不大.當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到2.5 h后，雖然多糖提取得率增大，但黃酮提取得率開始下降，可能是提取時(shí)間的延長(zhǎng)增加了雜質(zhì)的溶出量，或者是黃酮成分結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化.另外，提取時(shí)間的延長(zhǎng)降低了生產(chǎn)的效率.綜合考慮，選擇2.5 h為最佳的提取時(shí)間.

圖1 提取溫度對(duì)總黃酮與多糖提取得率的影響 圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮與多糖提取得率的影響

圖3 液料比對(duì)總黃酮與多糖提取得率的影響Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rates of total flavonoids and polysaccharides

方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性Model7．1090．7918．640．0025??A0．09010．0902．140．2038B0．2210．225．230．0710C4．9314．93116．560．0001??AB0．4110．419．680．0265?AC0．1410．143．320．1278BC0．7010．7016．480．0097??A20．3410．348．120．0358?B20．02110．0210．490．5147C20．3110．317．220．0435?殘差0．2150．042失擬項(xiàng)0．1730．0552．410．3066純誤差0．04620．023總和7．3114相關(guān)系數(shù)0．9711校正決定系數(shù)0．9190變異系數(shù)0．92

3.1.3 液料比對(duì)提取率的影響 設(shè)定提取溫度為85℃，提取時(shí)間為2.5 h，不同液料比下總黃酮和多糖提取得率如圖3所示.從圖2-3可以看出，隨著液料比的增加，總黃酮和多糖提取得率明顯升高，在液料比為20∶1時(shí)達(dá)到最大值，隨后開始下降，故選擇20∶1為最佳的液料比.

3.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

3.2.1 設(shè)計(jì)方案和結(jié)果 根據(jù)Box-behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表1、表2，方差分析如表3、表4.

表1 Box-behnken試驗(yàn)因素水平及編碼

Tab.1 Factors,levels and codes for Box-behnken design

因素與水平溫度A/℃時(shí)間B/h料液比C-1752．01∶150852．51∶201953．01∶25

表2 Box-behnken設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表—多糖提取得率

由表3可以看出，影響總黃酮提取得率的主次因素順序?yàn)椋毫弦罕?時(shí)間>溫度.其中C為極顯著影響因素，交互項(xiàng)BC達(dá)到極顯著水平，AB達(dá)到顯著水平，平方項(xiàng)A2、C2達(dá)到顯著水平.藤茶總黃酮提取得率的回歸方程：Y1=22.69+0.11A+0.17B+0.79C-0.32AB-0.19AC+0.42BC-0.3A2-0.075B2-0.29C2.經(jīng)分析得，在A=1.05，B=-1.75和C=0.21時(shí)，即提取溫度為95.5℃，提取時(shí)間為1.63h和料液比為1:21.05為藤茶總黃酮提取的最佳工藝條件，在此最佳的提取條件下，總黃酮與多糖提取得率預(yù)測(cè)值分別為22.49%和2.03%.

圖4給出了當(dāng)溫度、時(shí)間、料液比其中一個(gè)選取固定值時(shí)，其他兩因素及其交互作用對(duì)藤茶黃酮提取得率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖.

等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示交互效應(yīng)顯著，而圓形與之相反.從圖4可以看出，提取溫度和時(shí)間的交互作用顯著，提取時(shí)間與料液比的交互作用顯著，對(duì)藤茶黃酮提取得率有較大影響.

由表4可以看出，影響多糖提取得率的主次因素順序?yàn)椋簻囟?時(shí)間>料液比.其中A為極顯著影響因素，交互項(xiàng)AC達(dá)到極顯著水平，平方項(xiàng)A2達(dá)到極顯著水平.藤茶多糖提取得率的回歸方程：Y2=1.62+0.21A+0.046B+0.01AB+0.11AC+0.027BC+0.15A2+0.036B2.

經(jīng)分析得，在A=-0.016，B=0.065，C=-1.87，即提取溫度為84.84℃，提取時(shí)間為2.53 h，料液比為1∶10.65為提取藤茶多糖的最佳工藝條件，在此優(yōu)化提取工藝條件下，多糖與總黃酮提取得率預(yù)測(cè)值分別為1.62%和20.15%.

a料液比=1∶21.05

b時(shí)間=1.63 h

c溫度=95.5℃圖4 試驗(yàn)因素及其交互作用對(duì)藤茶黃酮提取得率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of cross-interactions among factors on extraction rate of total flavonoids

圖5給出了當(dāng)溫度、時(shí)間、料液比其中一個(gè)選取固定值時(shí)，其他兩因素及其交互作用對(duì)藤茶多糖提取得率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖.

a料液比=1∶10.55

b時(shí)間=1.53 h

c溫度=84.84℃圖5 試驗(yàn)因素及其交互作用對(duì)藤茶多糖提取得率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of cross-interactions among factors on extraction rate of polysaccharides

由圖5可以看出，提取溫度和料液比的交互作用顯著，提取時(shí)間與料液比的交互作用顯著，對(duì)藤茶多糖提取得率有較大影響.

綜合以上分析，采用提取總黃酮的最佳工藝對(duì)黃酮和多糖的提取得率均較高，可作為兩者同時(shí)提取的最佳工藝.由此確定，藤茶總黃酮和多糖的最佳提取工藝條件為：浸提溫度95.5℃，提取時(shí)間1.63 h和料液比1∶21.05.

3.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)合模型預(yù)測(cè)的最佳提取工藝條件，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整提取溫度為96℃，時(shí)間為1.6 h，料液比為1∶21，按此工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果總黃酮與多糖提取得率分別為22.94%和2.13%，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型與試驗(yàn)結(jié)果的可靠性.從結(jié)果可以看出，從藤茶中提取得到總黃酮多糖提取得率比文獻(xiàn)報(bào)道的偏低，這可能與使用的材料有關(guān)系.本試驗(yàn)所用的材料為藤茶葉加工成商品后的邊角料，其中含有較多的雜質(zhì).

4 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化的藤茶黃酮和多糖的綜合提取工藝條件為：浸提溫度95.5℃，時(shí)間1.63 h，料液比1∶21.05.根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整提取溫度為96℃，時(shí)間為1.6 h，料液比為1∶21.按此模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其結(jié)果為總黃酮提取得率為22.94%，多糖提取得率為2.13%.

從本試驗(yàn)的結(jié)論可以看出，藤茶加工后的下腳料中還含有較多的黃酮和多糖，可作為一種開發(fā)天然產(chǎn)物的資源加以充分利用，以減少資源浪費(fèi)，同時(shí)也能提高藤茶的綜合經(jīng)濟(jì)價(jià)值.

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OptimizationofExtractionProcessforFlavonoidsandPolysaccharidesfromFermentedAmpelopsisgrossedentata

XIAO Hao1，2,ZHENG Xiao-jiang2*

(1.Academy of Agricultural Sciences of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture,Enshi 445000,China； 2.School of Biological Science and Technology,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China)

On the basis of single-factor tests, response surface analysis (RSA) was used to optimize the extraction process of flavonoids and polysaccharides from fermentedAmpelopsisgrossedentata. The optimal conditions were as follows:extraction temperature was 96℃, extraction time was 1.6 h and solid-liquid ratio was 1∶21.Under these optimal conditions, the extraction rates of total flavonoids and polysaccharides were 22.49% and 2.03%,respectively.This optimal extraction process for total flavonoids and polysaccharides from fermentedAmpelopsisgrossedentatawill benefit the comprehensive development and utilization ofAmpelopsisgrossedentata.

fermentedAmpelopsisgrossedentata; flavonoids; polysaccharides; response surface analysis; optimal extraction

2013-04-04.

湖北省自然科學(xué)基金創(chuàng)新群體項(xiàng)目(2009CDA115)；湖北省研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2011BBB061).

肖浩(1986- )，男，碩士研究生，主要從事野生植物資源保護(hù)與利用的研究；*

：鄭小江(1958- )，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事野生植物資源保護(hù)與利用.

Q539

A

1008-8423(2013)02-0132-06