G-CSF對(duì)大鼠燒傷合并海水浸泡后內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響

王 培，管云楓，徐添穎，繆朝玉

隨著軍事斗爭準(zhǔn)備不斷深入，必須加強(qiáng)對(duì)未來的海上作戰(zhàn)救治的研究。在海上及登陸作戰(zhàn)時(shí)，可出現(xiàn)大批量的燒傷傷員，而且落水的可能性極大。海水具有高滲、高鈉、低溫的特點(diǎn)，燒傷后海水浸泡可引起嚴(yán)重的全身損害，并可進(jìn)一步發(fā)展為多臟器功能障礙綜合征，從而危及生命。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)是近10年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)皮系起源的祖細(xì)胞，其主要的生理功能是在發(fā)生創(chuàng)傷后趨化到創(chuàng)面，然后分化、增殖形成內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)血管，從而為器官、組織的最終修復(fù)提供血流輸供［1］。因此，EPC的數(shù)量和功能與血管修復(fù)能力及創(chuàng)面的愈合都有著密切的關(guān)系，EPC在燒傷合并海水浸泡后的變化可反映戰(zhàn)傷后的血管修復(fù)能力。但是，該方面的內(nèi)容國內(nèi)外均未見報(bào)道。故本研究以大鼠燒傷后合并海水浸泡模型觀察模型早期EPC的數(shù)量變化，以及使用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對(duì)EPC數(shù)量的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 8周齡SD大鼠26只［上海中科院動(dòng)物中心提供，許可證SCXK(滬)2003-0004］，雄性，體重250～300 g。隨機(jī)分為①對(duì)照組(n=6);②燒傷合并海水浸泡模型組(n=10):致傷后浸泡在人工配制的海水中3 h后撈出;③實(shí)驗(yàn)組(n=10):致傷后于海水浸泡3 h后下肢肌肉注射G-CSF(5 μg/kg)。各組大鼠在體重、鼠齡上無差異，造模后，分別在30 min、2 h、6 h和24 h從大鼠眼內(nèi)眥球后靜脈叢各取血0.5 ml，置于EDTA抗凝管。

1.2 人工海水的配制 按照國家海洋局第三海洋研究所提供的我國東南沿海海水成分配制，滲透壓1250 ～1350 mmol/L，pH 值 8.2，比重 1.05 ～1.06。實(shí)驗(yàn)室溫度25℃，人工海水溫度23～25℃。

1.3 動(dòng)物模型制作 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷前12 h禁食，采用10%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉。于背部30%區(qū)域剪毛備皮，用3%凝固汽油均勻涂擦，燃燒15 s后濕巾滅火，致30%背部區(qū)域的Ⅱ度燒傷。燒傷合并海水浸泡組致傷后將動(dòng)物置于固定架上，浸泡于人工海水中3 h，浸泡平面達(dá)劍突。

1.4 單個(gè)核細(xì)胞(PMBCs)分離 使用Ficoll(Amersham-Pharmacia公司，美國)梯度離心從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞。首先將外周血與等量0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH:7.2)混勻，緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液(2∶3)中，室溫下梯度離心。離心半徑15 cm，2400 rpm/min離心20 min，然后分離、收集單個(gè)核細(xì)胞層(淋巴細(xì)胞分離液與血漿中間的灰白色細(xì)胞層)。以含有1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，再懸浮于0.1 ml上述緩沖液中。

1.5 雙色熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測血EPC的數(shù)量

根據(jù)表面標(biāo)記為干細(xì)胞抗原-1(stem cell antigen-1，Sca-1)陽性以及血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor，VEGFR 2)陽性來確定血EPC數(shù)量。首先使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞(15 min)。然后加入10 μl異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗大鼠Sca-1抗體和10 μl藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的山羊抗大鼠VEGFR 2抗體［2］。室溫避光孵育2 h單個(gè)核細(xì)胞。以同型的IgG-FITC或IgG-PE染色作為陰性對(duì)照。每份標(biāo)本檢測105個(gè)細(xì)胞，獲得流式細(xì)胞散點(diǎn)圖，從中圈選單個(gè)核細(xì)胞散點(diǎn)區(qū)，對(duì)所圈選的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)FITC和PE雙陽性細(xì)胞比例，反映EPC數(shù)量變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燒傷合并海水浸泡對(duì)血EPC數(shù)量的影響 燒傷合并海水浸泡使血EPC數(shù)量顯著降低(P＜0.05，表1)。

2.2 G-CSF對(duì)抗燒傷合并海水浸泡對(duì)血EPC數(shù)量的影響 G-CSF在造模后2 h、6 h和24 h均顯著改善燒傷合并海水浸泡后血液中EPC數(shù)量下降趨勢(P＜0.05)，但造模30 min后對(duì)血EPC的數(shù)量影響不大(表1)。

3 討論

燒傷致死主要是因創(chuàng)面經(jīng)久不愈，以及感染導(dǎo)致的多臟器功能衰竭。目前公認(rèn)其發(fā)病機(jī)理是嚴(yán)重?zé)齻笠l(fā)過度應(yīng)激又發(fā)生自身毀損炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重者或繼發(fā)感染者則并發(fā)臟器功能障礙或衰竭。燒傷創(chuàng)面的修復(fù)反映了從血管損傷、通透性增加，到新生血管形成及過度增殖的變化過程，臨床表現(xiàn)為液體滲出、創(chuàng)面愈合、瘢痕形成等。修復(fù)過程復(fù)雜，影響因素眾多，極易產(chǎn)生不良后果［2-5］。在海上作戰(zhàn)，燒傷還往往伴有其他復(fù)合傷。若傷病員落水，被海水浸泡后，其感染幾率更高，生存率則更低［4-6］。內(nèi)皮細(xì)胞早已被證明在燒傷的愈合中具有重要意義［6-9］。燒傷合并海水浸泡可以嚴(yán)重?fù)p害內(nèi)皮功能［10］、凝血功能［11］，最終導(dǎo)致創(chuàng)面的微循環(huán)障礙［12］。

表1 各組血EPC實(shí)驗(yàn)結(jié)果(%)

EPC是一類存在于骨髓和全身循環(huán)血液中，能增殖、分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未成熟為血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，也未形成血管的前體細(xì)胞［13-15］。大量國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，EPC不僅參與血管形成，同時(shí)也參與出生后血管生成和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)。但是EPC的功能在燒傷中的作用則遠(yuǎn)未為人所知。最近3～5年以來，開始有EPC在燒傷中的作用的零星報(bào)道。2006年，謝松濤等［16］對(duì)燒傷患者臍血來源的EPC進(jìn)行純化鑒定及定向分化，發(fā)現(xiàn)EPC具有分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，并且參與了血管重建，具有促進(jìn)血管新生、加速缺血組織血管化的作用。Fox等［17］隨后在2008年發(fā)現(xiàn)在燒傷72 h后，EPC數(shù)量明顯增加。但是隨后 Groger等［18］和 Foresta等［19］分別發(fā)現(xiàn)了燒傷可以使早期(24 h)的血EPC數(shù)量明顯降低。而且，EPC數(shù)量下降最明顯的那些燒傷患者，預(yù)后最差，死亡率最高［19］。筆者猜測這種差異可能是因?yàn)闀r(shí)間點(diǎn)選擇的不同:燒傷后24 h和72 h EPC的動(dòng)員可能完全不一樣，燒傷后24 h，為骨髓中儲(chǔ)存著的EPC動(dòng)員入血;而在72 h后，則可能是經(jīng)過燒傷應(yīng)激后大量增殖形成的新EPC動(dòng)員入血。本文發(fā)現(xiàn)，在燒傷合并海水浸泡后24 h，大鼠的血EPC數(shù)量明顯低于對(duì)照組，和Groger等［18］和Foresta 等［19］的結(jié)果基本一致。

G-CSF屬于造血生長因子，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外許多重組的造血生長因子已投入生產(chǎn)［20］。G-CSF主要來源于巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及纖維母細(xì)胞，能高度特異性地刺激中性粒細(xì)胞系的前體細(xì)胞存活。早在1995年，曹麗萍等［21］就發(fā)現(xiàn)了燒傷患者的G-CSF濃度增高。G-CSF的增高有利于中性粒細(xì)胞的動(dòng)員、增加，從而有利于抑制感染，提高患者生存率。目前，G-CSF在臨床上已成為燒傷的常用藥［22］。但是，增加中性粒細(xì)胞的數(shù)量可能并不是促進(jìn)G-CSF對(duì)燒傷患者愈合作用的唯一機(jī)制。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，G-CSF顯著增加了血中的EPC數(shù)量，直接影響了新生內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量和在創(chuàng)傷局部的聚集。因此，EPC的數(shù)量無疑可以極大地影響燒傷合并海水浸泡的預(yù)后。據(jù)此可以初步推測:G-CSF的應(yīng)用會(huì)增加EPC的數(shù)量，而這種量的增加作用可能有利于燒傷、燒傷合并海水浸泡的創(chuàng)面恢復(fù)。

綜上所述，大鼠燒傷、燒傷合并海水浸泡復(fù)合傷時(shí)，血EPC數(shù)量在24 h內(nèi)下降明顯。而G-CSF的使用可逆轉(zhuǎn)這種趨勢，增加EPC數(shù)量，從而有利于創(chuàng)面愈合，增加血液EPC數(shù)量可能是G-CSF在燒傷合并海水浸泡治療中顯效的重要機(jī)制之一。

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