在SW480細(xì)胞中沉默survivin基因抑制細(xì)胞增殖及hTERT表達(dá)

王 平，肖 琳，董俊紅，李桂枝，趙春玲，王守訓(xùn)

(濰坊醫(yī)學(xué)院生化教研室，山東濰坊261042)

Survivin是在惡性腫瘤高表達(dá)的一種凋亡抑制基因，具有調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的雙重功能［1］。人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是維持端粒酶活性最重要的成分，細(xì)胞增殖失控與端粒酶的激活有關(guān)，端粒酶活化是細(xì)胞永生化或惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟［2］。目前，關(guān)于survivin基因干擾引起的腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡抑制的研究較多，但survivin對(duì)hTERT基因表達(dá)的影響報(bào)道較少。Survivin和hTERT的表達(dá)存在著相互聯(lián)系，研究表明［3－4］survivin可能是使端粒酶活性增高的轉(zhuǎn)錄因子。本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了靶向survivin基因的shRNA干擾載體，觀察survivin基因抑制對(duì)細(xì)胞增殖的影響，探討survivin干擾對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞hTERT基因表達(dá)的影響，其下調(diào)機(jī)制可能與Sp1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

1 材料

1.1 材料與方法

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系(中科院上海細(xì)胞庫);pGenesil-1.1質(zhì)粒(武漢晶塞公司);質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司);FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑和TRAPELISA試劑盒(Roche公司);兔抗人 survivin單抗(CST公司)，小鼠抗人 hTERT和 Sp1單抗(Santa Cruz公司)。細(xì)胞周期檢測試劑盒(碧云天公司)，引物及干擾序列的合成(北京六合華大基因公司)。

1.2 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù) GenBank中 survivin(NM_001168)和 Sp1(NM_138473)的cDNA序列，分別設(shè)計(jì)3組干擾序列，預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出高效、特異性強(qiáng)的干擾序列，survivin的靶向干擾序列5'-GGACCACCGCATCTCT ACA-3'，Sp1的靶向干擾序列為5'-ATCACTCCATGG ATGAAATGA-3'，并設(shè)計(jì)1條非特異性序列5'-AAG ACTTCATAAGGCGCATGC-3'作為陰性對(duì)照。將survivin和Sp1退火片段分別與線性化的pGenesil-1.1載體連接，即為 pGenesil-1.1-survivin和 pGenesil-1.1-Sp1;陰性對(duì)照與載體連接產(chǎn)物即為pGenesil-1.1-HK。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞

SW480細(xì)胞在含10%胎牛血清的L15培養(yǎng)液(北京邁晨公司)，37℃、無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h取對(duì)數(shù)生長期SW480細(xì)胞5×105個(gè)接種于6孔板中，觀察細(xì)胞生長至80%匯合時(shí)按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組(不加任何處理)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染 pGenesil-1.1-HK)、survivin-RNAi組(轉(zhuǎn)染 pGenesil-1.1-survivin)和 Sp1-RNAi組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1.1-Sp1)。

1.4 MTT檢測survivin基因干擾后細(xì)胞增殖能力的變化

將構(gòu)建的pGenesil-1.1-survivin和陰性對(duì)照重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至6孔板中SW480細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染12、24、48及72 h后，加入 MTT溶液(5 g/L)10μL培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上于570 nm波長測定各孔A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值)×100%。

1.5 MCF法檢測survivin基因干擾后細(xì)胞增殖周期的改變

將SW480細(xì)胞加入6孔板24 h后，轉(zhuǎn)染pGenesil-1.1-survivin重組質(zhì)粒，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照及陰性對(duì)照組，連續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，1 200 r/min，離心5 min，0.01 mmol/L PBS洗2次，加入70%冰乙醇，4℃固定過夜，離心沉淀并用PBS洗細(xì)胞1次，加入質(zhì)量濃度為10 mg/L碘化丙啶(PI)0.5 mL，37℃避光染色30 min，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時(shí)相變化。

1.6 Western blot檢測RNA干擾對(duì)蛋白表達(dá)影響

siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。每孔取50μg蛋白上樣進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST對(duì)膜封閉 1 h，加入一抗(兔抗人 survivin單抗1∶1 000稀釋;鼠抗人 Sp1和 hTERT單抗1∶500稀釋;鼠抗人β-actin單抗1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，次日分別加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶20 000稀釋)于室溫孵育1 h，洗滌后與ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)處理曝光，對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測RNA干擾對(duì)mRNA的影響

將轉(zhuǎn)染48 h后收集的細(xì)胞用 Trizol提取總RNA，參照說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行熒光定量PCR。使用2－△△Ct方法分析相對(duì)的基因表達(dá)水平。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物見表1。

表1 本研究中所用到的引物Table 1 The primers used in this study

1.8 TRAP-ELISE法檢測端粒酶活性

轉(zhuǎn)染48 h后收集裂解細(xì)胞，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取待測樣品 50μg，反應(yīng)體積為20μL，25℃，30 min延伸引物，然后在PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加入20μL變性試劑，25℃孵育10 min，再加入225μL雜交緩沖液，振蕩混勻后取100μL混合物加入已包被微孔板的孔中，37℃，300 r/min振蕩2 h，棄去雜交液，用緩沖液清洗3次;加入抗地高辛過氧化物酶100μL，25℃，30 min，再用緩沖液清洗5次;加入TMB底物溶液100μL，20 min后再加入100μL終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測吸光度A值代表端粒酶活性強(qiáng)度，A=端粒酶A450－端粒酶A690。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測survivin基因干擾后細(xì)胞增殖能力的變化

隨培養(yǎng)時(shí)間延長，survivin基因干擾組SW480細(xì)胞的增殖明顯減慢，24 h以后增殖抑制率明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(p＜0.05)，48 h時(shí)抑制率達(dá)到34.44%;48 h以后細(xì)胞增殖抑制率增加不明顯 (圖1)。

圖1 siRNA-survivin轉(zhuǎn)染對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effects of transfected with siRNA-survivin on proliferation of SW480 cells

2.2 survivin基因干擾對(duì)細(xì)胞增殖周期的影響

空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，survivin基因干擾組G0/G1期細(xì)胞顯著增多(p＜0.01)，S期和G2/M期細(xì)胞減少(圖2，表2)。

表2 各組細(xì)胞周期比率Table 2 Cell cycle distribution rate of groups，%，n=4)

表2 各組細(xì)胞周期比率Table 2 Cell cycle distribution rate of groups，%，n=4)

＊P ＜ 0.01 compared with control．

group G0/G1 S G2/M control 43.47±1.31 39.27±1.14 17.25±0.57 negative-control 43.46±1.42 39.45±0.84 17.09±0.76 siRNA-survivin 66.50±2.94* 27.36±1.86* 6.14±0.68*

2.3 靶向survivin RNA干擾對(duì)hTERT和Sp1基因表達(dá)的影響

構(gòu)建的pGenesi-l.1-survivin對(duì)SW480細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)具有明顯的干擾效果;同時(shí)發(fā)現(xiàn)在survivin基因干擾后，hTERT和Sp1的蛋白表達(dá)明顯降低(圖3A);hTERT和Sp1基因的mRNA明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組 (p＜0.01)(圖3B)。

2.4 靶向Sp1的RNA干擾對(duì)hTERT基因表達(dá)的影響

SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGenesil-1.1-Sp1后，Sp1蛋白表達(dá)明顯降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)hTERT蛋白表達(dá)也隨之降低(圖3C);Sp1基因干擾后，hTERT的mRNA表達(dá)也降低(p＜0.01)(圖3B)。

2.5 靶向survivin和Sp1的RNA干擾對(duì)端粒酶活性影響

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，survivin和Sp1基因干擾可以明顯降低端粒酶活性(p＜0.01)(圖4)。

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生與細(xì)胞增殖失控和凋亡異常有關(guān)。Survivin特異性的在細(xì)胞周期G2/M期表達(dá)，通過與細(xì)胞有絲分裂紡垂體的微管結(jié)合，參與對(duì)細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;suvrviin又是染色體過客蛋白在細(xì)胞分裂晚期參與染色體的分離和胞質(zhì)分裂的完成［5］，因此，survivin在細(xì)胞分裂增殖中扮演主要角色。在本研究中，通過構(gòu)建靶向survivin的RNA干擾表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，結(jié)果顯示能有效的抑制SW480細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。通過細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)survivin基因干擾能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在G0/G1期。同時(shí)發(fā)現(xiàn)survivin的mRNA和蛋白表達(dá)都明顯降低，與以往研究結(jié)果一致［6］。

hTERT是端粒酶活性調(diào)節(jié)的限速亞單位，與腫瘤細(xì)胞端粒酶活性密切相關(guān)。無端粒酶活性的正常細(xì)胞外源表達(dá)hTERT基因能重建端粒酶活性［7］，表明腫瘤細(xì)胞端粒酶的激活是誘導(dǎo)了hTERT表達(dá)的結(jié)果，而且是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。Sp1是結(jié)合到hTERT核心啟動(dòng)子GC富含位點(diǎn)和激活hTERT轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵分子，hTERT啟動(dòng)子富含GC盒，其核心啟動(dòng)子區(qū)包含5個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)的突變都導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性不同程度地降低，而當(dāng)5個(gè)Sp1位點(diǎn)同時(shí)突變，則核心啟動(dòng)子的活性下降至少90%［8］，故認(rèn)為Sp1是一個(gè)強(qiáng)大的hTERT轉(zhuǎn)錄激活因子。

在本研究中，檢測到在survivin基因干擾后，hTERT基因的mRNA和蛋白表達(dá)都顯著降低，端粒酶活性下降。提示survivin對(duì)hTERT基因表達(dá)具有一定的調(diào)控作用。為進(jìn)一步了解survivin基因干擾引起的hTERT基因表達(dá)下調(diào)的機(jī)制，構(gòu)建了靶向Sp1基因的干擾載體，通過對(duì)mRNA和蛋白水平的檢測，也發(fā)現(xiàn)Sp1基因表達(dá)降低后，hTERT基因表達(dá)同步下調(diào)，端粒酶活性降低。研究表明［3－4］，survivin通過作用于端粒酶的限速酶hTERT，使其Sp1和C-Myc磷酸化，導(dǎo)致hTERT的酶活性增加，進(jìn)而表現(xiàn)為端粒酶活性的升高。本研究證實(shí)，Sp1沉默后能夠有效抑制hTERT的表達(dá)，表明Sp1參與SW480細(xì)胞中hTERT基因表達(dá)調(diào)控從而調(diào)節(jié)端粒酶活性。此外，實(shí)驗(yàn)中檢測到survivin基因干擾后，Sp1的mRNA和蛋白表達(dá)水平同步降低。這些研究結(jié)果提示，survivin基因干擾可能是通過Sp1的表達(dá)下調(diào)，引起的hTERT基因表達(dá)降低，其確切機(jī)制有待于更深一步研究和探討。

［1］Mita AC，Mita MM，Nawrocki ST，et al．Survivin:key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics［J］．Clin Cancer Res，2008，14:5000 －5005．

［2］Shammas MA，Koley H，Batchu RB，et al．Telomerase inhibition by siRNA causes senescence and apoptosis in Barrett's adenocarcinoma cells:mechanism and therapeutic potential［J］．Mol Cancer，2005，4:24．

［3］Kumari A，Srinivasan R，Wig JD．Effect of c-MYC and E2F1 gene silencing and of 5-azacytidine treatment on telomerase activity in pancreatic cancer-derived cell lines［J］．Pancreatology，2009，9:360 －368．

［4］Yuan J，Yang BM，Zhong ZH，et al．Upregulation of Survivin during immortalization of nontransformed human fibroblasts transduced with telomerase reverse transcriptase［J］．Oncogene，2009，28:2678 －2689．

［5］Skoufias DA，Mollinari C，Lacroix FB，et al．Human Survivin is a kinetochore-associated passenger protein［J］．J Cell Biol，2000，151:1575 －1582．

［6］薛芳，段明英，陳燕．RNAi抑制survivin基因表達(dá)增加細(xì)胞凋亡［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，29:965－969．

［7］Takakura M，Kyo S，Kanaya T，et al．Cloning of human telomerase catalytic subunit(hTERT)gene promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for transcriptional activation in immortalized and cancer cells［J］．Cancer Res，1999，59:551 －557．

［8］ Turner EC，Kinsella BT．Transcriptional regulation of the human prostacyclin receptor gene is dependenton Sp1，PU．1 and Oct-1 inmegakaryocytes and endothelial cells［J］．J Mol Biol，2009，386:579 －597．