磁性納米顆粒與脂質體介導REST-siRNA轉染hADSCs的比較

王 瑞，龐希寧*，施 萍

人脂肪間充質干細胞(human adipose mesenchymal stem cells，hADSCs)在體外易于分離、擴增，在適當?shù)臈l件下具有多向分化潛能，并且可以進行自體移植，廣泛遷移，易與周圍組織整合而發(fā)揮功能［1］，提示其在細胞治療中可能成為非常有價值的運載細胞。隨著hADSCs在基因治療中的應用被人們廣為認識和研究，如何針對其建立安全、有效又具有優(yōu)良特性的RNA運載系統(tǒng)已成為現(xiàn)今研究的重點。

目前，基因導入載體主要分為病毒型和非病毒型。病毒型基因載體雖轉染效率較高，但具有誘導宿主免疫反應、潛在成瘤性、裝載容量有限和代價高等缺點［2］。因此，非病毒基因載體包括磁納米顆粒和脂質體的應用日益受到重視。脂質體是目前應用較多的非病毒載體;磁性納米顆粒因具有非侵襲性、低毒性和對細胞膜強大的穿透性等特點，被認為是很有前景的非病毒基因導入載體［3］。

本研究對磁納米顆粒和脂質體作為基因載體分別轉染hADSCs進行了比較。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人皮下脂肪組織樣本由中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院外科提供，并與患者簽署知情同意書。聚乙烯亞胺包被的磁性納米顆粒(東納生物科技有限公司)、DMEM/F12和胎牛血清(Hyclone公司)、100 IU/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素、0.25%胰蛋白酶和MTT試劑盒(Sigma公司)、REST-siRNA(上海吉瑪公司)、lipofectamineTM2000(Invitrogen公司)、反轉錄試劑盒、real-time試劑盒和 real-time引物(Takara公司)、REST一抗(Millipore公司)及二抗(北京鼎國公司)、ECL發(fā)光試劑盒 (GE Healthcare公司)。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs分離、培養(yǎng)及鑒定:將脂肪組織剪碎，去除血管和筋膜，加入2倍體積膠原蛋白酶Ⅰ在37℃消化1 h，每隔15 min輕柔振蕩1次。DMEM/F12培養(yǎng)液加10%胎牛血清進行中止并且離心洗滌2～3次，后轉移至培養(yǎng)瓶用DMEM/F12培養(yǎng)液加10%胎牛血清 在5%CO2、37℃飽和濕度孵箱內培養(yǎng)，待細胞80% ～90%匯合后予以傳代。取第3代培養(yǎng)細胞進行流式細胞術檢測 CD105、CD44和CD45抗原。

1.2.2 磁性納米顆粒介導REST-siRNA轉染hADSCs:取原代分離培養(yǎng)第3代以后的hADSCs接種6孔培養(yǎng)板，當細胞80% ～90%匯合后換液，將PEI-SPIO與REST-siRNA以8∶1混合，室溫靜置30 min后，將混合物加入到6孔板中，搖動混勻，設置未轉染細胞為對照組。

1.2.3 lipofectamineTM2000介導REST-siRNA轉染hADSCs:REST-siRNA與lipofectamineTM2000混合比例為0.8μg∶2μL。取 0.8μg REST-siRNA加入無血清培養(yǎng)基稀釋至50μL，另取lipofectamineTM2000 2μL加入無血清培養(yǎng)基稀釋至50μL，室溫靜置5 min，二組液體輕輕混勻后，室溫靜置20 min，然后加至待轉染hADSCs無血清培養(yǎng)基中，6 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，設置未轉染細胞為對照組。

1.2.4 磁性納米顆粒和 lipofectamineTM2000分別介導GFP進入細胞情況檢測:分別于標記24 h后，用熒光顯微鏡觀察轉染進GFP的hADSCs的情況。隨機計數(shù)顯微鏡10個視野下發(fā)出綠色熒光的細胞數(shù)，轉染效率 =發(fā)出綠色熒光的細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.5 MTT比色法檢測細胞活性:分別將轉染48 h后的hADSCs種入96孔板中，檢測各孔的細胞成活率及增殖活性。實驗重復3次。

1.2.6 實時定量PCR法檢測磁性納米顆粒和脂質體的瞬時干擾效率:分別收集未轉染及轉染REST-siRNA的hADSCs細胞，用總RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA。檢測濃度，用反轉錄試劑盒反轉錄成 cDNA。以 GAPDH為內參，ΔΔCt法計算REST mRNA的相對水平。SYBR Premix Ex TaqTMTaKaRa試劑盒用來實時定量PCR檢測目的基因在各組細胞中的表達。所用引物如下:REST上游引物:5'-ATTGAAGTTGGCTTAGTG-3';下游引物:5'-TATGGGTAGATTCGTTGA-3';以GAPDH為內參，上游引物:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物:5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3';反應體系:2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物(10μmol/L)各 0.8μL，ROX DyeⅡ 0.4 μL，cDNA 2μL，雙蒸水6μL。反應條件為 95℃ 30 s，95℃5 s，60℃延伸34 s，循環(huán)40次，做熔解曲線。每個反應有3次重復。

1.2.7 Western blot法檢測磁納米顆粒法和脂質體法瞬時干擾效率:按常規(guī)方法收集轉染及未轉染細胞，加入適量RIPA緩沖液，4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清。樣品經SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉過夜，在10 mL含5%脫脂奶粉的TBST中加入4μL REST抗體，4℃搖床(100 r/min)孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯色。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 hADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

人脂肪間充質干細胞在分離后3 d貼壁生長，成長梭形，可見細胞系，分散排列，懸浮的球形細胞經換液后逐漸減少。培養(yǎng)11 d后，倒置顯微鏡下可觀察到細胞克隆，出現(xiàn)致密的貼壁層(圖1)。取第3代培養(yǎng)細胞進行流式細胞術鑒定，結果細胞CD105、CD44和CD45表面抗原表達陽性率分別為99.4%、99.7%和2.7%(圖2)。

2.2 熒光顯微鏡觀察磁性納米顆粒和脂質體作為基因載體時的轉染效率

轉染進GFP的hADSCs發(fā)出綠色熒光，磁納米顆粒和脂質體的轉染效率無差異，分別為75%和71%(圖3)。

2.3 磁納米顆粒和脂質體作為基因載體轉染hADSCs后對其活性的影響

轉染48 h后，未轉染組hADSCs的A570為0.80±0.03，磁性納米顆粒組轉染hADSCs的A570為0.75±0.06，脂質體組轉染 A570為0.64±0.04(p＜0.05)(圖4)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察不同時期培養(yǎng)人脂肪間充質干細胞細胞形態(tài)Fig 1 Inverted microscope was used to observe the culture of human adipose mesenchymal stem cells cell morphology in different periods(×40)

圖2 流式細胞術鑒定hADSCsFig 2 Flow cytometry analysis were performed on the hADSCs

圖3 熒光顯微鏡觀察磁納米顆粒與脂質體轉染效率Fig 3 Fluorescence microscope was used to observe the transfection efficiency of magnetic nanoparticles and lipofectamineTM 2000(×40)

4 MTT法檢測磁性納米顆粒和脂質體轉染hADSCs對其增殖的影響Fig 4 Cell proliferation activity was detected with MTT method after magnetic nanoparticles andlipofectamineTM 2000 transfect hADSCs

2.4 Western blot檢測磁性納米顆粒作為基因載體時REST的表達

磁納米顆粒作為基因載體介導REST-siRNA轉染hADSCs后REST的蛋白表達量為0.501±0.006，顯著低于對照組的0.924±0.003(p＜0.05)(n=3)(圖5)。

2.5 Real-time PCR檢測磁納米顆粒作為基因載體時REST的表達

磁納米顆粒作為基因載體介導REST-siRNA轉染hADSCs后REST的RNA表達量為0.46±0.04，顯著低于對照組的1.00±0.08(p＜0.05)。

2.6 Western blot檢測脂質體作為基因載體時REST的表達

脂質體作為基因載體介導REST-siRNA轉染hADSC后 REST的蛋白表達量為0.523±0.004，顯著低于對照組的1.000±0.007(p＜0.05)(n=3)(圖6)。

圖5 Western blot檢測磁納米顆粒作為基因載體時REST的表達Fig 5 Western blot result of REST expression after magnetic nanoparticles transfect hADSCs

圖6 Western blot檢測脂質體作為基因載體時REST的表達Fig 6 Western blot result of REST expression after lipofectamineTM 2000 transfect hADSCs

2.7 Real-time PCR檢測脂質體作為基因載體時REST的表達

脂質體作為基因載體介導REST-siRNA轉染hADSCs后REST的RNA表達量為0.53±0.05，顯著低于對照組的1.00±0.04(p＜0.05)。

3 討論

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)不但可以作為種子細胞移植進目標組織內，分化替代為相對應的組織功能細胞，還可以作為基因治療的載體細胞［4－6］。hADSCs與骨髓來源的 MSC具有相似的多向分化能力，且具有容易獲取、體內分布廣、取材創(chuàng)傷小、可多次抽取、采集效率高以及細胞獲得量大等優(yōu)點。因此，hADSCs作為種子細胞在組織工程中具有很好的應用前景。

基因轉染細胞的方法有病毒載體介導和非病毒載體介導兩種。病毒載體雖然轉染率高，如慢病毒載體轉染 MSCs可有高達95%的轉染率［7－8］;反轉錄病毒介導的MSCs轉染效率達到80%～90%［9－10］，但面臨安全性、免疫排斥等問題［10－11］。磁納米顆粒是目前新興的非病毒基因轉染系統(tǒng)，它是一種MRI對比劑，其特點是粒徑小，穿透力強，且具有生物可降解性［12－15］。用磁納米顆粒標記干細胞，采用核磁共振成像(MRI)進行活體示蹤的研究技術在不斷完善。脂質體轉染方法是目前應用最多的非病毒介導的基因轉染系統(tǒng)，但有顯著缺點，例如對細胞有明顯毒性。故本實驗對磁納米顆粒和脂質體體外轉染基因至hADSCs進行了比較，研究新型脂質體LipofectamineTM2000和磁納米顆粒介導的轉染方法應用于轉基因細胞移植領域的前景及探討作為基因轉染載體的可行性。結果表明:磁納米顆粒細胞毒性低于脂質體，轉染效率和瞬時干擾效率與脂質體相當，故可代替脂質體作為轉染干細胞的基因載體。

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