門(mén)多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina P10脂肪酶基因的克隆及其在酵母中的表達(dá)

王建榮，陳麗芝，羅長(zhǎng)財(cái)，鐘開(kāi)新，聶金梅，李陽(yáng)源

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東珠海519060）

脂肪酶（Lipase，E.C.3.1.1.3），全稱為三酰基甘油酰水解酶（triacylglycerol acylhydrolase），它屬于α/β折疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶催化三酰甘油的酯鍵水解，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸[1]。脂肪酶主要來(lái)源于動(dòng)植物和微生物中，相對(duì)于動(dòng)植物，微生物分泌的脂肪酶具有更廣的底物專一性、作用溫度以及作用pH范圍。脂肪酶在微生物界分布很廣，目前已發(fā)現(xiàn)曲霉[2]、根霉[3]、假單胞菌[4]等多種微生物可產(chǎn)脂肪酶。在眾多來(lái)源的脂肪酶中，來(lái)源于假單胞菌屬的脂肪酶廣泛應(yīng)用于各個(gè)工業(yè)領(lǐng)域，包括食品工業(yè)、洗滌工業(yè)、手性拆分和藥物合成等領(lǐng)域中。如門(mén)多薩假單胞菌的脂肪酶用于洗滌劑添加劑、熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌的脂肪酶則被廣泛用于有機(jī)合成等[5]。由于來(lái)源于假單胞菌的脂肪酶具有良好的應(yīng)用特性，為了進(jìn)一步提高假單胞菌分泌脂肪酶的能力，許多學(xué)者開(kāi)始應(yīng)用分子生物學(xué)的方法研究其脂肪酶基因的克隆、表達(dá)、調(diào)控等。到目前為止已有多種假單胞菌的脂肪酶基因被克隆并且實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，如熒光假單胞菌[6]、銅綠假單胞菌[7]、洋蔥勃克霍爾德菌[8]等。本研究采用同源克隆法得到了門(mén)多薩假單胞菌的脂肪酶基因并對(duì)該基因進(jìn)行了分析，同時(shí)將該基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中，進(jìn)行了初步的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步研究該基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表達(dá)載體pPICZαA、Pichia pastoris X-33 購(gòu)自Invitrogen公司；門(mén)多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina P10 購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌Top10、高保真Pfu酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR純化試劑盒 均購(gòu)自上海生工公司；PCR引物合成以及DNA測(cè)序 均由深圳華大基因公司完成；其他生化試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Biometra熱密閉PCR儀T-1 德國(guó)Biometra公司；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Nano Drop分光光度計(jì)ND-1000 美國(guó)Nano Drop公司；電泳儀DYY-6C 北京市六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 門(mén)多薩假單胞菌基因組DNA的提取 挑取單菌落接入50mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min培養(yǎng)過(guò)夜，離心取菌體，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA。用Nano Drop分光光度計(jì)（ND-1000）測(cè)定DNA的濃度，選取A260/A280值在1.8～2.0的樣品，置于冰箱中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脂肪酶基因的克隆 經(jīng)過(guò)分析NCBI上已報(bào)道的Pseudomonas mendocina NK-01的全基因組DNA序列（Genebank登錄號(hào)為：CP002620.1），設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，上游引物：5’-ATCGGAATTCATGGCCAGTCTTCC GCTGTAT-3’和下游引物：5’-ATATGCGGCCGCCTA GCCCTTCATCGGCGCATC-3’（分別含有EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)）。以提取的門(mén)多薩假單胞菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1μL（約50ng），上、下游引物各2μL，2×Pfu Master Mix 50μL，用ddH2O補(bǔ)充到總體積為100μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min后，分別于94℃變性50s，58℃退火50s和72℃延伸1min，共33個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定正確后切膠純化存于冰箱中-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 表達(dá)載體pPICZαA-pml的構(gòu)建 pPICZαA質(zhì)粒和目的基因PCR產(chǎn)物都用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，切膠純化后，用T4DNA連接酶16℃過(guò)夜連接酶切產(chǎn)物，然后用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coli Top10，在含25μg/mL Zeocin的LB培養(yǎng)基平板上涂板，過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。將陽(yáng)性質(zhì)粒提交華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 序列分析 核酸和氨基酸序列的比對(duì)在NCBI BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上進(jìn)行，核酸序列分析用DNAman 5.0完成，蛋白結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測(cè)在Swissprot（http：//www..expasy.ch/sprot）網(wǎng)站上提供的鏈接的平臺(tái)上進(jìn)行。

1.2.5 重組畢赤酵母的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)以及酶活檢測(cè) 重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行線性化后，使用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X-33，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有100μg/mL的Zeocin YPD平板上，30℃培養(yǎng)2～3d，進(jìn)行菌落PCR鑒定。挑取經(jīng)菌落PCR鑒定的轉(zhuǎn)化子，接種于含有50mL BMGY培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃，250r/min振蕩培養(yǎng)16～20h至OD600達(dá)到2～6。離心收集菌體，再將其重懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至OD600為0.8～1.0，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24h向BMMY培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇至終濃度為1.0%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)測(cè)定重組菌的菌體濃度和脂肪酶酶活。脂肪酶活性定量測(cè)定采用堿滴定法，具體步驟參照文獻(xiàn)[9]中報(bào)道的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 門(mén)多薩假單胞菌脂肪酶基因pml的克隆及序列比對(duì)

以提取的門(mén)多薩假單胞菌基因組DNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)PCR產(chǎn)物大小約為820bp，大小與理論值相符（見(jiàn)圖1）。將該目的片段回收并克隆入表達(dá)載體pPICZαA，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切鑒定，片段大小正確（見(jiàn)圖2），測(cè)序結(jié)果表明，pml基因全長(zhǎng)為801bp，起始和終止密碼子分別為ATG和TAG，推測(cè)其完整的ORF編碼267個(gè)氨基酸。利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST軟件分析表明，推測(cè)的門(mén)多薩假單胞菌脂肪酶的氨基酸序列同其他已知細(xì)菌的脂肪酶氨基酸序列有較高的相似性。其中最高的為Pseudomonas mendocina NK01（相似性為97%），其次為Pseudomonas mendocina DLHK（相似性為82%）。采用DNAman 5.0進(jìn)行同源比對(duì)分析（見(jiàn)圖3），發(fā)現(xiàn)門(mén)多薩假單胞菌脂肪酶基因pml的氨基酸序列中含有高度保守的“Gly-X-Ser-X-Gly”五肽功能元件。研究表明，該功能元件在脂肪酶識(shí)別和結(jié)合底物方面發(fā)揮著重要的作用[10]。同時(shí)在該脂肪酶氨基酸序列中還發(fā)現(xiàn)了構(gòu)成脂肪酶活性中心催化活性位點(diǎn)的三個(gè)氨基酸殘基（Ser-Asp-His），它們分別位于156、212、247位。通過(guò)以上分析表明從門(mén)多薩假單胞菌中克隆得到了完整的脂肪酶基因。

圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Digestion and identification of recombinant plasmid

圖3 脂肪酶氨基酸序列多重比對(duì)圖Fig.3 The multiplex alignment of the lipase

2.2 門(mén)多薩假單胞菌脂肪酶基因pml生物信息學(xué)分析

門(mén)多薩假單胞菌脂肪酶基因pml編碼297個(gè)氨基酸，利用在線軟件Protparam預(yù)測(cè)表明，該脂肪酶的等電點(diǎn)和相對(duì)分子量大小分別為4.82、29.95ku，半衰期理論值為30h，不穩(wěn)定參數(shù)為61.80，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。利用在線網(wǎng)站SinglelP4.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽定位，結(jié)果顯示該氨基酸序列不含有信號(hào)肽。采用在線軟件ProtScale分析此蛋白的疏水性和親水性，發(fā)現(xiàn)第21位的丙氨酸和22位的谷氨酸的疏水性最強(qiáng)（分值為2.189），位于第41位的精氨酸親水性最強(qiáng)（分值為-2.967）。用SOPMA對(duì)此蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，在該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲的含量最大為47.74%，其次為α螺旋含量為34.59%，延伸鏈的含量為15.41%，而β轉(zhuǎn)角的含量最少為2.26%。通過(guò)NCBI網(wǎng)站上的conserve domain對(duì)該氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示該序列屬于脂肪酶超家族中的第三類脂肪酶。

2.3 重組畢赤酵母的構(gòu)建以及篩選

Zeocin抗性平板上長(zhǎng)出數(shù)百個(gè)轉(zhuǎn)化子（見(jiàn)圖4），隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別以畢赤酵母X-33的基因組DNA和構(gòu)建好的脂肪酶表達(dá)載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示。重組菌和陽(yáng)性對(duì)照都能擴(kuò)增出一條820bp大小的條帶，與預(yù)期大小相符，表明重組質(zhì)粒已成功整合到了畢赤酵母基因組中。

圖4 擬轉(zhuǎn)化子Fig.4 Putative transformants

圖5 擬轉(zhuǎn)化子PCR鑒定Fig.5 PCR detection of putative transformants

2.4 重組轉(zhuǎn)化子脂肪酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測(cè)定

按照方法“1.2.5”對(duì)篩選的重組畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24h取樣測(cè)量發(fā)酵液的菌體濃度和上清發(fā)酵液的脂肪酶酶活。結(jié)果如圖6所示，誘導(dǎo)到168h時(shí)，菌體濃度達(dá)到最高，菌體濃度為432g/L；誘導(dǎo)至192h時(shí)，酶活力達(dá)到最大為8U/mL。

圖6 重組畢赤酵母生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線Fig.6 Cell growth and lipase production of recombinant yeast

3 結(jié)論

采用同源克隆法從門(mén)多薩假單胞菌中克隆得到脂肪酶基因，該基因全長(zhǎng)801bp，編碼267個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)該脂肪酶基因的序列及其編碼的氨基酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：該脂肪酶基因與已報(bào)道的脂肪酶基因具有很高的相似性，相似性最高可達(dá)97%；同時(shí)在該脂肪酶氨基酸序列中還存在“Gly-X-Ser-X-Gly”五肽功能元件以及脂肪酶活性中心催化活性位點(diǎn)的三個(gè)氨基酸殘基（Ser-Asp-His），通過(guò)保守區(qū)域分析，該脂肪酶適于脂肪酶超家族中的第三類脂肪酶。將該脂肪酶基因連接到pPICZαA表達(dá)載體上轉(zhuǎn)化Pichia pastoris X-33，脂肪酶基因在Pichia pastoris X-33中實(shí)現(xiàn)了分泌性表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間誘導(dǎo)到168h時(shí)，菌體濃度達(dá)到最高，菌體濃度為432g/L；誘導(dǎo)至192h時(shí)，酶活力達(dá)到最大為8U/mL。

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