食前熱水處理提高鮮切黃瓜微生物安全性的研究

張?zhí)鹛?，李天琪，王慶國(guó)，王 敏

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018）

鮮切蔬菜具有方便、營(yíng)養(yǎng)、新鮮、可食率高等特點(diǎn)，在發(fā)達(dá)國(guó)家廣受消費(fèi)者的歡迎[1-3]，也將是我國(guó)蔬菜供應(yīng)的發(fā)展方向之一。很多鮮切蔬菜品種，既可生食，又可加熱烹調(diào)食用。保證生食鮮切蔬菜的食用安全性是世界各國(guó)廣泛關(guān)注的重要研究課題。然而，至今尚沒(méi)有安全、有效的解決方法。過(guò)去10年[4]，鮮切蔬菜食源性致病菌導(dǎo)致的食品安全事件在發(fā)達(dá)國(guó)家也時(shí)有發(fā)生。鮮切蔬菜從田間生長(zhǎng)、采收及后續(xù)的運(yùn)輸、加工、包裝及貨架銷售過(guò)程中，均存在著食源性致病菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。前人的研究[5-8]多集中在避免污染和采后加工中，應(yīng)用二氧化氯、細(xì)菌素等化學(xué)或生物抗菌劑和低溫、氣調(diào)、輻照等物理方法控制食源性致病菌，從成品前食源性致病菌得到很好控制，但從市場(chǎng)銷售到食用前的過(guò)程中，少量的食源性致病菌仍有可能快速繁殖，使人致病。為此，食前徹底消除食源性致病菌是保證消費(fèi)者食用安全的最后且十分關(guān)鍵的措施，然而，過(guò)去的研究極少。食用前的處理，既可在酒店、餐廳等食品服務(wù)部門(mén)，也可在家庭進(jìn)行。熱處理是一種最廣泛應(yīng)用的物理殺菌方法，可以有效地殺死食源性致病菌[9-11]。前人也有在加工過(guò)程中，熱處理抑制鮮切蔬菜食源性致病菌的研究，然而由于殺死食源性致病菌的熱條件往往對(duì)鮮切蔬菜造成熱損傷，至今沒(méi)有得到應(yīng)用[12]。熱處理導(dǎo)致的熱損傷當(dāng)時(shí)可能不顯現(xiàn)，而在貯藏期或貨架期表現(xiàn)出來(lái)，但食用前熱處理則可避免這些后顯現(xiàn)的熱損傷，從而提高熱處理的強(qiáng)度和殺菌效果。我國(guó)民間有部分生鮮蔬菜食用前熱處理的做法，但這僅是經(jīng)驗(yàn)，缺少科學(xué)支持。本研究旨在探討食用前熱水處理徹底殺滅鮮切黃瓜上食源性致病菌，保證食用安全，又保持其鮮度的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所使用的黃瓜 購(gòu)自山東省濟(jì)南市濟(jì)陽(yáng)縣花園小區(qū)，選擇優(yōu)質(zhì)、無(wú)腐爛、無(wú)機(jī)械傷、大小均勻的黃瓜為材料，于10℃的冷庫(kù)中貯藏，24h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)菌株單增李斯特菌（ATCC 19111）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（ATCC 13311），所用培養(yǎng)基Brain-Heart Infusion agar（BHIA，腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基）、PALCAM agar（PALCAM瓊脂培養(yǎng)基）和Hektoen Enteric agar（HE，腸道菌瓊脂培養(yǎng)基）及無(wú)菌均質(zhì)袋 均由北京陸橋技術(shù)有限公司提供。

YXQ-LS-SⅡ型立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；微量移液槍 上海宙輝生化儀器有限公司；BHC-1300IIA2型生物安全柜 蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司；PX-300B-G型微電腦光照培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HBM-400B型拍擊式均質(zhì)機(jī) 天津市恒奧科技有限公司；DDS-307型電導(dǎo)率儀 上海偉業(yè)儀器廠；TA-XT2i型物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro System公司；普析通用T6新世紀(jì)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Pocket refractometer Pal-1型手持糖量計(jì) 日本ATAGO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 實(shí)驗(yàn)分四部分進(jìn)行：a.熱水處理鮮切黃瓜并進(jìn)行感官評(píng)定；b.體外熱水處理食源性致病菌（鼠傷寒沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌）；c.熱水處理染菌的鮮切黃瓜，并測(cè)定殘余致病菌數(shù)量；d.測(cè)定熱水處理對(duì)鮮切黃瓜品質(zhì)（硬度、細(xì)胞膜透性、可溶性固形物含量、抗氧化活性）的影響。

1.2.2 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜感官品質(zhì)的影響 將在本地市場(chǎng)上購(gòu)買的新鮮黃瓜用清水洗凈，實(shí)驗(yàn)室條件（25℃）風(fēng)干，切成4～5mm厚的薄片，進(jìn)行表1所示處理，處理之后立即用20℃冷水冷卻1min，對(duì)鮮切黃瓜進(jìn)行感官評(píng)定。表1所示處理?xiàng)l件根據(jù)文獻(xiàn)資料[13]及熱水處理鮮切黃瓜的預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

表1 熱水處理鮮切黃瓜條件Table 1 Temperature and time of hot water treatments for fresh-cut cucumber

1.2.3 菌懸液制備及接種 無(wú)菌操作條件下，將致病菌接種于腦心浸液瓊脂平板上，于（37±1）℃培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)物，用無(wú)菌蛋白胨水（0.85%）將菌苔洗下，制成菌懸液，菌懸液濃度約為8log CFU/mL[14]。無(wú)菌操作條件下，將鮮切黃瓜在菌懸液中浸沾10min，風(fēng)干0.5h。

1.2.4 體外熱水處理食源性致病菌 將9mL無(wú)菌水加入到試管中，加熱至需要溫度，迅速加入1mL菌懸液，同時(shí)計(jì)時(shí)，達(dá)到需要的時(shí)間后取出，迅速用涼水（20℃）冷卻，不加熱的試管樣品作為對(duì)照。對(duì)于每一個(gè)處理，各自吸取1mL，加入到9mL 0.85%的無(wú)菌蛋白胨水中，制成10-2稀釋液，如此連續(xù)稀釋。

1.2.5 熱水處理接種的鮮切黃瓜 據(jù)1.2.2和1.2.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇熱水處理?xiàng)l件，在無(wú)菌條件下，對(duì)接種的鮮切黃瓜進(jìn)行熱水處理。處理完成后，每25g裝入一個(gè)無(wú)菌袋中，加入225mL無(wú)菌蛋白胨水，用均質(zhì)拍打機(jī)處理60s（6h/s），制成1∶10的樣品勻液。準(zhǔn)確吸取1∶10的樣品勻液1mL，放入裝有9mL 0.85%無(wú)菌蛋白胨生理鹽水的試管中迅速振搖，制成10-2濃度的稀釋液，如此連續(xù)稀釋。

1.2.6 食源性致病菌的計(jì)數(shù) 對(duì)于每一個(gè)樣品，選用合適的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。分別吸取100μL樣品液加到HE瓊脂培養(yǎng)基/PALCAM瓊脂培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布至干。每個(gè)稀釋度的樣品液涂布兩個(gè)平皿（如果某一樣品液在取出供試部分前的放置時(shí)間超過(guò)3min，應(yīng)按上述方法再振搖該樣品液）。

涂布完成后，翻轉(zhuǎn)平皿，于（36±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h。根據(jù)同一稀釋度的兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值或兩個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算出每克樣品中菌落數(shù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 鮮切黃瓜感官評(píng)定 鮮切黃瓜感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[7]如表2所示。

表2 鮮切黃瓜感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standard for organolrptic evaluation of fresh-cut cucumber

1.3.2 鮮切黃瓜細(xì)胞膜透性的測(cè)定 參考趙世杰等[15]方法，采集圓柱狀果肉，切成1mm厚組織圓片，50mL去離子水淋洗，吸干表面水分，裝入盛有15mL去離子水的具塞試管中，真空泵抽氣20min，25℃保溫1h，測(cè)定初電導(dǎo)值（S1）以及所用無(wú)離子水的電導(dǎo)（S0），測(cè)畢，置沸水浴10min，取出后在25℃水浴中平衡10min，搖勻，測(cè)終電導(dǎo)（S2）。相對(duì)電導(dǎo)率（L，%）=[（S1－S0）/（S2－S0）]×100。

1.3.3 鮮切黃瓜硬度測(cè)定 應(yīng)用TA-XT2i物性測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)定。

測(cè)定參數(shù)[16]為：測(cè)量模式：TPA；測(cè)量參數(shù)：測(cè)試前速度：1.0mm/s，測(cè)試速度：0.5mm/s，測(cè)試后速度：1.0mm/s，距離：1.0mm，時(shí)間：3.0s；探頭：P5（直徑5mm）。

1.3.4 鮮切黃瓜可溶性固形物含量測(cè)定 用日本ATAGO PAL-1數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)定。

1.3.5 鮮切黃瓜抗氧化活性測(cè)定 采用DPPH法測(cè)定，參照胡喜蘭等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Sigmaplot 12.1（Systat Software Inc，USA）統(tǒng)計(jì)作圖，方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)（LSD）用SPSS 16.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切黃瓜熱水處理?xiàng)l件的初步確定

由表1預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選鮮切黃瓜熱水處理?xiàng)l件見(jiàn)表3。由表3可以看出，熱水處理會(huì)降低鮮切黃瓜的感官品質(zhì)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇鮮切黃瓜硬度、顏色及口感評(píng)分都在4以上的熱水處理溫度及時(shí)間，進(jìn)行體外熱水處理食源性致病菌的實(shí)驗(yàn)。

表3 不同熱水處理?xiàng)l件對(duì)鮮切黃瓜感官品質(zhì)的影響Table 3 Effect of hot water treatment on organoleptic evaluation of fresh-cut cucumber

2.2 鮮切黃瓜熱水處理?xiàng)l件的最終確定

由圖1～圖2可以看出，體外熱水處理可以有效降低食源性致病菌的數(shù)量，60℃ 5min、70℃ 1min、70℃2min、80℃15s、80℃ 30s、85℃ 15s、85℃ 30s及90℃15s條件下，可減少鼠傷寒沙門(mén)氏菌的數(shù)量為2.53～4.87log CFU/mL，減少單增李斯特菌的數(shù)量為2.53～4.97log CFU/mL。溫度越高，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌的滅殺效果越好；相同的溫度條件下，時(shí)間越長(zhǎng)滅殺效果越好。隨熱水處理?xiàng)l件的變化，兩種菌的變化趨勢(shì)一致。其中，90℃15s熱水處理?xiàng)l件效果最好，減少鼠傷寒沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌的數(shù)目分別為4.87、4.97log CFU/mL。由此可以看出，與低溫較長(zhǎng)時(shí)間處理相比，高溫瞬時(shí)處理能更有效地殺滅食源性致病菌。結(jié)合感官品質(zhì)評(píng)定結(jié)果，選取60℃5min，70℃ 1min，70℃ 2min，80℃ 15s，85℃ 15s以及90℃15s作為鮮切黃瓜的熱水處理?xiàng)l件。

圖1 體外熱水處理對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的滅殺效果Fig.1 Inactivity of hot water treatment for S.Typhimurium in vitro

圖2 體外熱水處理對(duì)單增李斯特菌的滅殺效果Fig.2 Inactivity of hot water treatment for L.monocytogenes in vitro

2.3 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜上食源性致病菌的滅殺效果

由圖3～圖4可以看出熱水處理可以有效減少鮮切黃瓜表面食源性致病菌的數(shù)目，在初始染菌濃度為5.42log CFU/g的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和5.16log CFU/g的單增李斯特菌條件下，常溫清水浸泡1min減少鼠傷寒沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌的數(shù)目分別為0.43、0.02log CFU/g，熱水處理減少兩種菌的數(shù)目均≥0.77log CFU/g，其中，60℃ 5min及70℃ 2min熱水處理的鮮切黃瓜檢測(cè)不到鼠傷寒沙門(mén)氏菌的存在，同時(shí)60℃5min熱水處理也檢測(cè)不到單增李斯特菌的存在；而高溫瞬時(shí)熱水處理，如80℃ 15s，85℃ 15s和90℃15s對(duì)兩種食源性致病菌的滅殺效果明顯不如60℃ 5min，70℃ 1min和70℃ 2min熱水處理，說(shuō)明與高溫短時(shí)間處理相比，低溫較長(zhǎng)時(shí)間熱水處理能更有效地減少鮮切黃瓜表面的食源性致病菌。

圖3 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜表面鼠傷寒沙門(mén)氏菌的滅殺效果Fig.3 Inactivity of hot water treatment for S.Typhimurium on fresh-cut cucumber

圖4 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜表面單增李斯特菌的滅殺效果Fig.4 Inactivity of hot water treatment for L.monocytogenes on fresh-cut cucumber

2.4 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜品質(zhì)的影響

相對(duì)電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，其值越大，表示電解質(zhì)的滲漏量越多，細(xì)胞膜受害程度越重[18]，由圖5可知熱水處理的鮮切黃瓜相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照樣品，說(shuō)明熱水處理嚴(yán)重破壞了鮮切黃瓜的細(xì)胞膜，導(dǎo)致鮮切黃瓜品質(zhì)下降。

圖5 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of hot water treatment on relative electroconductibility

圖6和圖7中可以看出熱水處理對(duì)鮮切黃瓜的硬度和可溶性固形物含量影響不大，只有70℃ 2min熱水處理顯著降低了鮮切黃瓜的硬度值，其他處理樣品與對(duì)照之間沒(méi)有明顯差異。

圖6 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜硬度的影響Fig.6 Effect of hot water treatment on firmnessfirmness

圖7 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜可溶性固形物的影響Fig.7 Effect of hot water treatment on soluble solids

圖8可以看出，熱水處理顯著降低了鮮切黃瓜的抗氧化活性（損失58.47%～63.95%），熱水處理樣品之間的抗氧化活性值沒(méi)有明顯差別。

圖8 熱水處理對(duì)鮮切黃瓜抗氧化值的影響Fig.8 Effect of hot water treatment on antioxidant activity

實(shí)驗(yàn)中采用DPPH法測(cè)定鮮切黃瓜抗氧化活性，綜上所述，60℃ 5min、70℃ 1min、70℃ 2min、80℃15s、85℃ 15s、90℃ 15s熱水處理會(huì)破壞鮮切黃瓜的細(xì)胞膜，降低其抗氧化活性，但對(duì)鮮切黃瓜的硬度和可溶性固形物含量影響不明顯（除70℃2min熱水處理顯著降低了樣品的硬度外）。

3 結(jié)論與討論

3.1 本研究結(jié)果表明，熱水處理顯著降低了鮮切黃瓜上和試管中鼠傷寒沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌數(shù)量，但是熱水中實(shí)驗(yàn)與鮮切黃瓜的結(jié)果有所不同。體外熱水實(shí)驗(yàn)中，高溫短時(shí)間的熱水處理比較低溫度和較長(zhǎng)時(shí)間的熱水處理更能有效地減少食源性致病菌，而在熱水處理鮮切黃瓜上趨勢(shì)相反，可能的原因是長(zhǎng)時(shí)間的熱水處理能更有效地減少致病菌在鮮切黃瓜上的附著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Spinks等[19]的研究結(jié)果一致，55～65℃對(duì)清除致病菌是關(guān)鍵溫度范圍，并且支持了熱水操作體系最低溫度為60℃的理論。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱水處理顯著提高了鮮切黃瓜的相對(duì)電導(dǎo)率，降低了其抗氧化活性，但是除70℃2min熱水處理顯著降低了樣品的硬度外，其他條件均對(duì)鮮切黃瓜的硬度及可溶性固形物的含量沒(méi)有明顯的影響，而且感官品質(zhì)仍在可接受范圍，這說(shuō)明適宜的熱水處理可以作為殺滅食源性致病菌，保持鮮度的技術(shù)措施。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，60℃5min熱水處理的鮮切黃瓜，食源性致病菌從高起始染菌量降低到檢測(cè)線以下，而且感官上仍然鮮脆。

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