咖啡酸衍生物對(duì)自由基致D N A氧化損傷的聯(lián)合保護(hù)作用

李瑞銳，尹文琴，李 磊，王 麗，陳麗君，戴金鳳

（南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京211166）

大量人群流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究表明，自由基參與機(jī)體多種疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，是血管損傷、細(xì)胞癌變、神經(jīng)病變的原始引發(fā)機(jī)制之一[1-3]。清除自由基、提高機(jī)體抗氧化能力，是許多藥物防治慢性疾病的重要途徑[4-5]?？Х人峒捌溲苌飳儆诙喾宇?lèi)植物化學(xué)物。多酚類(lèi)植物化合物對(duì)心腦血管、糖尿病腎病及癌癥等慢性非傳染性疾病具有很好的預(yù)防作用[6-8]。CADs廣泛存在于以唇形科、菊科、薔薇科、十字花科等植物性食品或膳食中[9-12]。食用富含CADs的食物對(duì)心腦血管疾病、細(xì)胞損傷惡變引發(fā)的腫瘤等有一定的防治作用[13-14]。目前，CADs單體的抗氧化、抗菌、抗腫瘤、保肝等多方面的生物活性已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)[15-17]，但多種CADs對(duì)機(jī)體的聯(lián)合保護(hù)作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用食品/膳食中常見(jiàn)的三種CADs，運(yùn)用DPPH自由基、·OH反應(yīng)模型和CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系，研究其清除自由基及對(duì)·OH自由基致DNA損傷的保護(hù)作用。探討膳食復(fù)雜體系中多種植物化學(xué)成分防治慢性非傳染性疾病作用效果，為植物化學(xué)物整合作用研究和膳食干預(yù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠原酸（ChA，純度99%）、阿魏酸（FeA，純度99%）、迷迭香酸（RoA，純度99%）、維生素C（VitC）、小牛胸腺DNA 美國(guó)Sigma公司；DPPH（純度95%）、鄰啡咯啉（Phen） Johnson Mathey公司；甲醇 色譜純；過(guò)氧化氫（30%）、乙醇、甲醇、醋酸銨、濃鹽酸、硫酸銅 均為分析純。

Orion II高靈敏度板式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀 德國(guó)BertholdDS公司；InfiniteM200熒光酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；梅特勒MS105DU分析天平 德國(guó)賽多利斯公司；SSW型電熱恒溫水槽 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[17]，DPPH溶液和樣品質(zhì)量濃度梯度的配制（DPPH溶液現(xiàn)配現(xiàn)用）：精確配制質(zhì)量濃度為720μg/mL DPPH溶液作為儲(chǔ)備液。應(yīng)用時(shí)，將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋15倍，質(zhì)量濃度為48μg/mL。實(shí)驗(yàn)分為8組（ChA、FeA、RoA、ChA+FeA（1∶1）、ChA+RoA（1∶1）、FeA+RoA（1∶1）、ChA+FeA+RoA（1∶1∶1）、VitC）。每組都分為200、100、50、25μg/mL四個(gè)濃度。

反應(yīng)體系及清除率計(jì)算：將100μL不同質(zhì)量濃度的樣品和等量的DPPH自由基分別加入96孔板中，每孔反應(yīng)體積共200μL液體，每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)平行樣，每隔2min測(cè)一次吸光度（Aj），空白為A0（200μL甲醇），陰性對(duì)照Ai（100μL DPPH·+100μL甲醇），陽(yáng)性對(duì)照（100μL DPPH+100μL VitC），按式（1）計(jì)算DPPH清除率。

1.2.2 ·OH清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18]，用0.1mol/L醋酸鹽緩沖液（pH5.5）配制CuSO4-Phen-VitC溶液，在化學(xué)發(fā)光儀微孔板中依次加入CuSO4-Phen-VitC混合液100μL、不同組合CADs溶液60μL、H2O220μL。對(duì)照組用60μL緩沖液補(bǔ)齊，每組做3個(gè)平行樣，立即測(cè)定發(fā)光反應(yīng)值。根據(jù)發(fā)光值繪制發(fā)光反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線，以曲線峰值計(jì)算·OH清除率，觀察不同組合CADs對(duì)·OH的清除作用。不同組合CADs樣品孔發(fā)光強(qiáng)度以CLj表示，醋酸鹽緩沖液對(duì)照組發(fā)光強(qiáng)度以CLi表示?！H清除率計(jì)算公式見(jiàn)式（2）。

1.2.3 CADs對(duì)·OH致DNA損傷的保護(hù)作用 參照文獻(xiàn)[19]，用0.1mol/L醋酸鹽緩沖液（pH5.5）配制CuSO4-Phen-VitC-DNA溶液。在化學(xué)發(fā)光儀微孔板中依次加入CuSO4-Phen-VitC-DNA混合液、100μL、60μL不同組合的植物化學(xué)物溶液（對(duì)照組用60μL緩沖液補(bǔ)齊），最后加入20μL H2O2啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，立即測(cè)定發(fā)光反應(yīng)值（CL）。每組做3個(gè)平行試樣。以DNA損傷產(chǎn)生的鳥(niǎo)嘌呤特征性化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及峰值出現(xiàn)時(shí)間的變化，觀察不同組合多酚類(lèi)植物化學(xué)物作用下抑制DNA損傷的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CADs對(duì)DPPH自由基的清除作用

不同濃度的CADs對(duì)DPPH自由基均有清除作用見(jiàn)表1。在相同的作用時(shí)間內(nèi)，在25～200μg/mL內(nèi)CADs對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增加，并且質(zhì)量濃度越大清除率越高。但在100μg/mL后，各種質(zhì)量濃度的CADs對(duì)自由基的清除率變化不明顯。

表1 CADs對(duì)DPPH自由基的清除率（%±SD，n=3）Table 1 The change in scavenging rate of CADs against DPPH free radicals（%±SD，n=3）

表1 CADs對(duì)DPPH自由基的清除率（%±SD，n=3）Table 1 The change in scavenging rate of CADs against DPPH free radicals（%±SD，n=3）

注：*，與同濃度VitC作用比較，有顯著性差異（p<0.05）；#，與同濃度ChA+FeA+RoA作用比較，有顯著性差異（p<0.05）。

名稱(chēng)濃度（μg/mL）25 50 100 200 ChA 12.99±0.38 34.41±0.24* 68.46±0.14*# 69.01±0.23 FeA 17.74±0.25 49.30±0.92* 60.29±0.19*# 65.51±0.18 RoA 8.47±2.19 28.83±1.41* 52.99±0.79*# 57.53±1.24 ChA+FeA 19.80±1.25 47.71±1.75* 80.64±1.32*# 81.89±1.19 ChA+RoA 21.93±1.23 38.93±1.45* 74.63±1.03*# 74.61±1.12 FeA+RoA 20.39±1.32 38.39±1.35* 76.39±0.45*# 76.93±1.47 ChA+FeA+RoA 28.93±1.12 58.39±0.49* 83.93±0.54* 84.09±0.75 VitC 13.39±0.48 32.99±0.87 72.33±1.68 72.99±0.83

相同質(zhì)量濃度下，兩種CADs聯(lián)用組合以及三種CADs聯(lián)用組合的DPPH自由基的清除率大于單成分組。其中三種CADs聯(lián)用對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)。當(dāng)ChA+FeA+RoA組合質(zhì)量濃度為200μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到84.09%。實(shí)驗(yàn)證明多成分聯(lián)用的效果在對(duì)DPPH自由基清除率的能力明顯強(qiáng)于單一成分以及兩種成分聯(lián)用，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所選的三種多酚類(lèi)植物化學(xué)物之間存在著一定的協(xié)同作用。

2.2 CADs對(duì)·OH自由基的清除作用

CADs的濃度越大發(fā)光峰值越小，則其對(duì)·OH自由基的清除率越大。表2為各個(gè)實(shí)驗(yàn)組合在不同濃度下對(duì)·OH自由基的清除率。不加CADs溶液的空白對(duì)照組的發(fā)光峰值相對(duì)較高，實(shí)驗(yàn)組因加入不同組合CADs化學(xué)發(fā)光峰值很低，發(fā)光峰值下降程度明顯，則其對(duì)·OH自由基的清除率大下降程度明顯。相同質(zhì)量濃度下組合（ChA+FeA+RoA）對(duì)·OH自由基清除作用最強(qiáng)，其中當(dāng)組合（ChA+FeA+RoA）濃度為25、50、100、200μg/mL時(shí)，對(duì)發(fā)光峰的抑制率分別33.43%、55.27%、71.23%、77.49%，顯示了CADs對(duì)·OH自由基具有明顯的清除作用，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，即CADs質(zhì)量濃度越大發(fā)光峰值下降程度越明顯。多成分聯(lián)用更加有效的提高了CADs防止羥自由基引起的DNA損傷的效果。

表2 CADs對(duì)·OH自由基的清除率（%±SD，n=3）Table 2 The change in scavenging rate of CADs against·OH free radicals（%±SD，n=3）

表2 CADs對(duì)·OH自由基的清除率（%±SD，n=3）Table 2 The change in scavenging rate of CADs against·OH free radicals（%±SD，n=3）

注：*，與同濃度空白對(duì)照比較，有顯著性差異（p<0.05）；#，與同濃度ChA+FeA+RoA作用比較，有顯著性差異（p<0.05）。

名稱(chēng)濃度（μg/mL）25 50 100 200空白對(duì)照 11.46±0.15 13.73±0.21 15.11±0.32 19.74±0.45 ChA 19.79±0.38 23.92±0.24* 38.46±0.14* 49.01±0.71 FeA 17.77±0.25 28.49±0.92* 40.29±0.13* 45.51±0.78 RoA 18.47±2.19 25.21±0.71* 42.99±0.22* 47.53±1.24 ChA+FeA 29.30±1.52 35.24±0.75*# 60.64±1.32*# 61.89±1.14 ChA+RoA 27.94±1.23 34.27±1.54*# 64.63±1.21*# 65.61±1.21 FeA+RoA 25.39±1.32 41.38±1.35*# 66.39±0.47*# 66.93±1.74 ChA+FeA+RoA 33.43±0.72 55.27±0.49* 71.23±0.54* 77.49±0.75

2.3 CADs對(duì)·OH致DNA損傷的保護(hù)作用

如表3所示，不同質(zhì)量濃度的CADs加入CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA體系后，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光抑制率。

由表3可看出，不同比例的CADs均能有效防止羥自由基引起的DNA損傷。CADs能使DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光峰較空白對(duì)照組有明顯下降；CADs的濃度越大發(fā)光峰值下降程度明顯，其對(duì)DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光抑制率越大。不同組CADs對(duì)DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光抑制率為12.49%～81.09%。其中三種成分聯(lián)用組的作用最強(qiáng)，對(duì)DNA損傷產(chǎn)物發(fā)光抑制率高達(dá)81.09%。

表3 不同組合CADs對(duì)CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA體系化學(xué)發(fā)光的影響Table 3 Effect of different group of CADs at various concentrations on chemiluminescence intensity of CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA system

3 討論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用DPPH和·OH自由基反應(yīng)模型和酶標(biāo)儀觀察不同組合CADs對(duì)自由基的淬滅效應(yīng)。DPPH自由基是一種合成的有機(jī)自由基。通過(guò)對(duì)DPPH這種能穩(wěn)定存在的自由基清除能力的檢測(cè)，可以反映樣品在體內(nèi)清除DPPH自由基的活性[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CADs有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。多種CADs聯(lián)合使用顯示出了協(xié)同清除DPPH自由基的能力。用CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定不同組合CADs對(duì)·OH致DNA損傷的協(xié)同抑制作用[21]，結(jié)果表明，不同組合CADs能有效清除DPPH和·OH自由基，聯(lián)用應(yīng)用能協(xié)同抑制·OH引發(fā)的DNA氧化損傷程度。

自由基的生成與許多疾病密切相關(guān)，如衰老、心臟病、動(dòng)脈硬化、靜脈炎、關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏、早老性癡呆、冠心病及癌癥等[22-24]。多酚類(lèi)植物化學(xué)物是一類(lèi)天然抗氧化劑，具有抗炎、抗氧化、消除自由基作用與免疫抑制等多種藥理作用[25]。多種成分多酚類(lèi)植物化學(xué)物聯(lián)合抗氧化和抑制自由基的課題日益成為研究熱點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，多成分CADs聯(lián)用較單一成分具有更好的保護(hù)機(jī)體DNA氧化損傷的作用。但由于本實(shí)驗(yàn)局限于體外模型，對(duì)CADs聯(lián)合在體內(nèi)的代謝及吸收機(jī)制還不很明確，體內(nèi)清除自由基及對(duì)DNA的氧化損傷作用還有待進(jìn)一步研究。

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