超聲微波協(xié)同萃取蜂膠中黃酮類物質(zhì)的研究

余晶晶，童群義

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

蜂膠是由蜜蜂從植物芽孢和枝條上采集的樹脂分泌物與蜜蜂消化腺分泌液和蜂蠟混合之后形成的一種具有黏性的天然混合物[1]。迄今為止，人們從蜂膠中已分離并鑒定出的物質(zhì)有300多種，包括黃酮類、酚類、醇類、酯類、烴類、氨基酸等，其中黃酮類化合物是蜂膠的主要功能性成分，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫力的藥理作用[2-4]，所以蜂膠現(xiàn)已成為各國(guó)在醫(yī)藥食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。我國(guó)是蜂產(chǎn)品生產(chǎn)大國(guó)，蜂膠原料來源非常豐富。原蜂膠中含有較多雜質(zhì)，不能直接給人服用，所以在蜂膠進(jìn)行深加工前必須對(duì)蜂膠進(jìn)行提純，國(guó)內(nèi)外用于食品和藥品的蜂膠主要采用乙醇、水或超臨界CO2做提取溶劑，用這些溶劑主要提取蜂膠的活性成分黃酮類物質(zhì)[5]。研究表明水的提取率明顯低于乙醇[6]，而超臨界CO2萃取是近代提取分離中的一種新型分離技術(shù)，具有萃取速度快、效率高、無污染的特點(diǎn)，但其方法要求的裝備復(fù)雜，故投資成本較高[7]。超聲微波協(xié)同萃取法是固體萃取中超聲波法及微波法發(fā)展而來的新技術(shù)新方法[8]。此法充分利用超聲波振動(dòng)的空化作用[9]及微波的高能作用[10]，克服了常規(guī)浸提、超聲波和微波萃取之不足，實(shí)現(xiàn)了低溫常壓環(huán)境下，對(duì)固體樣品快速，高效、可靠的處理，成本相對(duì)超臨界CO2萃取也較低。目前關(guān)于該提取方法在蜂膠應(yīng)用方面研究還比較少。本文以粗蜂膠為提取原料，以乙醇為提取溶劑，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)研究得出提取蜂膠中總黃酮的最優(yōu)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗蜂膠 江蘇省慶緣康生物科技有限公司，冷凍粉碎過60目篩，低溫保藏；蘆丁（標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%）阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、AI（NO3）3、NaNO2、NaOH 國(guó)藥試劑有限公司，分析純。

CW-2000超聲微波協(xié)同萃取儀 超聲波固定頻率40kHz，功率50W，上海新拓分析儀器科技有限公司；UV-2100紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；AB104-N電子天平 Mettler-Toledo Instr（ShangHai）Ltd；FA1004電子天平 上海天平儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂膠中總黃酮含量與提取率的測(cè)定

1.2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.03272g置于100mL容量瓶，用無水乙醇配制成0.3272mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確量取0、1、2、3、4、5mL分別加入第1～6號(hào)容量瓶（25mL）中，加水至6mL，加5%NaNO2溶液lmL，搖勻，靜置10min，然后加10%Al（NO3）3溶液lmL搖勻，靜置10min；再加入4%NaOH溶液10mL，50%乙醇溶液稀釋至刻度搖勻放置15min。以空白溶液作為對(duì)照，用1cm比色皿于510nm處測(cè)量吸光值，以蘆丁溶液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=12.806x-0.0096，R2=0.999。

1.2.1.2 總黃酮含量的測(cè)定[9]取蜂膠提取液，用無水乙醇稀釋定容至250mL，然后取1mL稀釋液于25mL容量瓶中，以下按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出溶液黃酮濃度（mg/mL）。

總黃酮（以蘆丁計(jì)，%）=c×V×K/m×103×100

式中：c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的黃酮濃度，mg/mL；V為蜂膠黃酮提取液中體積，mL；K為提取液稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.1.3 提取率的測(cè)定 將超聲微波協(xié)同萃取過的蜂膠液通過真空泵經(jīng)布氏漏斗抽濾到錐形瓶中，抽濾前稱量濾紙質(zhì)量，再用少量乙醇沖洗萃取容器和濾紙多次，將殘?jiān)盀V紙?jiān)谑覝叵赂稍镏梁阒亍?/p>

提取率（%）=（W－W1＋W2）/W×100

式中：W為粗蜂膠質(zhì)量，g；W1為濾紙質(zhì)量+濾渣質(zhì)量，g；W2為濾紙質(zhì)量，g。

1.2.2 超聲微波協(xié)同萃取蜂膠中的黃酮

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以蜂膠提取液中黃酮含量及蜂膠提取率為指標(biāo)，考察乙醇濃度、料液比、微波功率、提取時(shí)間四個(gè)因素對(duì)提取效果的影響，以確定后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)各因素水平。

a.乙醇濃度對(duì)提取效果的影響：準(zhǔn)確稱取粗蜂膠1.0g，確定料液比1∶20（W∶V），提取時(shí)間60s，微波功率100W不變，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的條件下進(jìn)行微波超聲協(xié)同萃取，萃取后抽濾定容至250mL，后按照1.2.1.2、1.2.1.3的方法分別測(cè)定黃酮含量及提取率。

b.料液比對(duì)提取效果的影響：準(zhǔn)確稱取粗蜂膠1.0g，確定乙醇濃度70%，提取時(shí)間60s，微波功率100W不變，料液比（W∶V）分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的條件下進(jìn)行微波超聲協(xié)同萃取，萃取后抽濾定容至250mL，后按照1.2.1.2、1.2.1.3的方法分別測(cè)定黃酮含量及提取率。

c.提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響：準(zhǔn)確稱取粗蜂膠1.0g，確定乙醇濃度70%，料液比1∶20（W∶V），微波功率100W不變，提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150、180s的條件下進(jìn)行微波超聲協(xié)同萃取，萃取后抽濾定容至250mL，后按照1.2.1.2、1.2.1.3的方法分別測(cè)定黃酮含量及提取率。

d.微波功率對(duì)提取效果的影響：確稱取蜂膠1.0g，確定乙醇濃度70%，料液比1∶20（W∶V），提取時(shí)間60s不變，微波功率分別為50、75、100、125、150、175、200、225、250W的條件下進(jìn)行微波超聲協(xié)同萃取，萃取后抽濾定容至250mL，后按照1.2.1.2、1.2.1.3的方法分別測(cè)定黃酮含量及提取率。

1.2.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)。因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響 如圖1所示，提取液中總黃酮含量和提取率先隨乙醇濃度的增加而增高，乙醇濃度為70%時(shí)達(dá)到最高值，后隨乙醇濃度增加而下降。這可能是因?yàn)榉淠z中的黃酮類化合物，其中一些是易溶于水的，一些是易溶于乙醇的，而在超聲微波的作用下，在70%濃度左右，醇溶性和水溶性的黃酮類物質(zhì)都能最大程度地溶出。因此選擇濃度70%左右的乙醇作為后續(xù)提取溶劑，此時(shí)蜂膠的提取率也較為理想。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.1 Influence of ethanol concentration on extraction effect

2.1.2 料液比對(duì)提取效果的影響 如圖2所示，液料比1∶10～1∶20時(shí)，總黃酮含量增加，在料液比為1∶20時(shí)，提取液總黃酮含量與蜂膠提取率均達(dá)到了最高值，之后這兩個(gè)指標(biāo)均隨著溶劑用量的增加而有所下降且下降趨勢(shì)比較明顯。這是由于溶劑中黃酮濃度很低，溶劑量越大，與物料及溶劑邊界層的黃酮濃度差也越大，擴(kuò)散推動(dòng)力增大，所以提取率增大，當(dāng)溶劑量進(jìn)一步增大時(shí)，溶劑自身的吸熱效應(yīng)及水分含量的增多，都會(huì)影響提取效率。另外，料液比增大，會(huì)增加原料成本及后續(xù)濃縮工藝的成本，因此選用料液比1∶20左右范圍的比較合理。

圖2 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.2 Influence of solid-liquid ratio on extraction effect

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響 如圖3所示，整體來說提取時(shí)間對(duì)提取效果影響不明顯，提取率隨時(shí)間增加呈不明顯的上升趨勢(shì)，黃酮含量在120s達(dá)到了最高值，之后隨時(shí)間增加變化平緩甚至有所下降，這有可能是部分黃酮被破壞的緣故。以黃酮含量考慮來說，選擇提取時(shí)間120s左右比較合理。超聲微波協(xié)同萃取所采用的時(shí)間與傳統(tǒng)方法相比縮短了30h以上，提取效果也優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.3 Infuence of extraction times on extraction effect

2.1.4 微波功率對(duì)提取效果的影響 如圖4所示，提取液中總黃酮含量隨著微波功率的增加逐步上升，功率在75W以后陡然上升，達(dá)到150W以后黃酮含量上升趨勢(shì)不明顯。蜂膠提取率在功率50～75W上升趨勢(shì)比較明顯，功率在100W以后變化不明顯。這些可能是由于微波對(duì)細(xì)胞膜的破碎作用隨著功率的增加而逐漸增強(qiáng)，從而有利于提取，當(dāng)達(dá)到150W左右后提取率基本保持不變，說明黃酮類物質(zhì)大部分已溶入乙醇溶液中。另外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)微波在較高功率下乙醇溶液非常容易沸騰以至沖出冷凝管，影響實(shí)驗(yàn)，所以選用微波功率為150W左右范圍的條件進(jìn)行提取。

圖4 微波功率對(duì)提取效果的影響Fig.4 Influence of microwave power on txtraction effect

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

以蜂膠黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)（見表2），極差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)提取效果影響大小順序?yàn)锳＞C＞D＞B。方差分析結(jié)果表明（見表3），A因素對(duì)結(jié)果有顯著差異。因此，最佳提取條件為A1B1C3D3，即乙醇濃度65%，料液比1∶15，時(shí)間150s，微波功率175W。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及極差分析Table 2 Results and range analysis of orthogonal experiment

以蜂膠提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)（見表2），極差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)提取效果影響大小順序D＞B＞A＞C。方差分析結(jié)果表明（見表3），D因素即微波功率對(duì)結(jié)果有顯著差異，而A、B、C因素對(duì)結(jié)果沒顯著差異。由表3可得出原最佳的提取條件是A3B1C2D3，但因考慮到溶劑成本，可將最優(yōu)提取條件確定為A1B1C2D3，即乙醇濃度65%，料液比1∶15，時(shí)間120s，微波功率175W。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

最佳提取工藝確定：由于實(shí)驗(yàn)主要以黃酮含量為主要指標(biāo)，且不同提取條件下的提取率相對(duì)黃酮含量變化幅度較小，因此，最佳提取工藝條件確定為黃酮含量提取最高的組合，即A1B1C3D3，即乙醇濃度65%，料液比1∶15，時(shí)間150s，微波功率175W。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)選擇的最佳提取條件A1B1C3D3進(jìn)行提取，計(jì)算黃酮含量及提取率，得出的結(jié)果為黃酮含量為30.64%，高于正交實(shí)驗(yàn)（表2）的結(jié)果，且此條件下提取率為70.38%也較為理想，因此選擇的最佳提取工藝可行。

2.4 不同實(shí)驗(yàn)方法比較

表4 不同實(shí)驗(yàn)方法比較結(jié)果Table 4 Comparison of different experimental methods

按照表4的因素水平，實(shí)驗(yàn)分別采用常規(guī)提取法、超聲提取法、微波提取法、超聲微波協(xié)同萃取法對(duì)蜂膠進(jìn)行提取，提取結(jié)果見表4?？梢姵曃⒉▍f(xié)同萃取具有明顯的優(yōu)勢(shì)，尤其是提取時(shí)間上，比常規(guī)提取法縮短了很長(zhǎng)時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)室條件下，若提取條件相同，超聲微波協(xié)同萃取的效率顯著比單純的超聲波提取法和單純的微波提取法高?？赡苁且?yàn)槌暡梢约铀儆行С煞值臄U(kuò)散釋放并使物料與溶劑充分混合再加上微波的高能作用共同促進(jìn)了乙醇的浸入，加速了黃酮類化合物的溶出。因此，作為一種含量分析的樣品處理是一種較理想的萃取方式，但這種方法因?yàn)槟壳霸O(shè)備的限制會(huì)給工業(yè)化生產(chǎn)帶來一定的困難，如若能克服這些困難，在不久的將來無疑是一種值得考慮的新型提取技術(shù)。

3 結(jié)論

通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定超聲微波協(xié)同萃取蜂膠的最佳條件是乙醇濃度65%，料液比1∶15，時(shí)間150s，微波功率175W。該條件下，蜂膠提取液中總黃酮含量為30.64%，蜂膠提取率為70.38%。

不同提取方式的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲微波協(xié)同萃取法的提取效率比單純的超聲波法、微波法和常規(guī)提取法顯著要高，除了速度快、能耗小等優(yōu)點(diǎn)外，還能夠避免長(zhǎng)時(shí)間高溫高壓條件下導(dǎo)致萃取活性物質(zhì)的分解，克服了常規(guī)超聲波和微波萃取之不足，實(shí)現(xiàn)了低溫常壓條件下，對(duì)固體樣品進(jìn)行快速、高效、可靠的預(yù)處理，是一種可考慮的樣品處理新方式。

[1]葉振生，駱尚驊，李海燕，等.蜂產(chǎn)品深加工技術(shù)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2003：275-282.

[2]Burdock GA.Review of the biological properties and toxicity of bee propolis[J].Food Chem Toxicol，1998，36（4）：347-348.

[3]葉陸星，胡福良.蜂膠中黃酮化合物的生物學(xué)活性[J].養(yǎng)蜂科技，2002（2）：9-12.

[4]胡福良.蜂膠的抗菌作用及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用[J].養(yǎng)蜂科技，2000（3）：23-25.

[5]顧青，張燕萍，蘇杰，等.蜂膠中有效成分提取工藝研究[J]．食品工業(yè)，2001（2）：38-40.

[6]張?jiān)葡?，楊志孝，安蔚，?不同溶劑對(duì)蜂膠黃酮提取率影響的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（1）：9-10.

[7]顏偉玉，李琳，謝國(guó)秀.超臨界萃取技術(shù)及其在蜂產(chǎn)品加工中的應(yīng)用[J].養(yǎng)蜂科技，2006（1）：36-37.

[8]王志高，武華宜，易夢(mèng)雅.超聲微波協(xié)同萃取枇杷葉多糖的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2008，29（8）：207-209.

[9]劉元法，王興國(guó)，金青哲.超聲波技術(shù)提取蜂膠黃酮類功能性物質(zhì)的研究[J].食品科學(xué)，2004，25（6）：36-39.

[10]郭華，葉礅昊，李次力.微波對(duì)蜂膠黃酮提取率的研究[J].江蘇食品與發(fā)酵，2001（2）：10-12.