倒卵葉五加多糖脫色工藝研究

李小蓉，黃毓娟，權(quán) 彥

（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽712046）

倒卵葉五加是五加科五加屬植物，多年生落灌葉木。其根和莖的成分與刺五加藥用成分相似，藥理臨床實驗證明無毒，能調(diào)整機體新陳代謝機能，增強對疾病的抵抗能力，扶正固本，益氣健脾，補腎安神，助睡眠，增食欲，壯陽。對神經(jīng)衰弱、冠心病、高血壓、低血壓癥療效顯著[1]。有研究報道倒卵葉五加多糖（AOPS）具有免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]。AOPS不僅能增強腹膜巨噬細胞的吞噬作用和特異抗體的產(chǎn)生，而且還能拮抗對抗腫瘤劑的抑制作用。因此對倒卵葉五加多糖的研究具有重要意義。但是，倒卵葉五加中存在的大量色素，給多糖的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定帶來很大困難，因此需要對多糖進行脫色的工藝優(yōu)化比較研究。目前多糖脫色的方法主要有雙氧水法、活性炭法和樹脂法。使用活性炭脫色雖然具有原料易得，操作簡單，價格低廉，脫色率較高等優(yōu)點，但是由于活性炭對多糖也會產(chǎn)生吸附，導(dǎo)致多糖的損失率比較高，而且脫色后溶液中的活性炭殘渣也難以完全除去。因此，該方法并不是一種非常理想的脫色方法。雙氧水法脫色效率和多糖保留率較高，并且操作簡單，成本較低，是一種比較好的脫色方法[4]。樹脂法具有使用范圍廣，脫色率較高等優(yōu)點，也是一種比較好的脫色方法[5]。因此，本文采用雙氧水法和樹脂法對倒卵葉五加多糖進行了脫色工藝的研究，以期找到適合工業(yè)化生產(chǎn)的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

倒卵葉五加藥材 西安萬壽路中藥材市場；AB-8、LS-700B、803、840樹脂 西安藍深特種樹脂有限公司；H2O2、苯酚、考馬斯亮藍G-250、濃硫酸、乙醚、無水乙醇等試劑 均為國產(chǎn)分析純。

ZHWY-200B恒溫振蕩器 上海智城分析儀有限公司；FA2004電子天平 上海精科天平廠；RET basic恒溫加熱磁力攪拌器 IKA R公司；UV-2501PC紫外可見分光光度儀 日本島津公司；RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗多糖的提取 將倒卵葉五加藥材干燥后粉碎。按料液比1∶10加水提取，在水浴鍋中攪拌反應(yīng)，當(dāng)溫度升高至80℃時開始計時2h，將提取液過濾、濃縮，濃縮液用4倍體積無水乙醇醇析，醇析液靜置24h，然后真空抽濾，分別用無水乙醇、丙酮、乙醚淋洗濾餅后，干燥即得倒卵葉五加粗多糖[6]。

1.2.2 樹脂的預(yù)處理 新購樹脂→95%乙醇浸泡24h→蒸餾水洗至無醇味→5%HCl浸泡2h→蒸餾水洗至pH為中性→5%NaOH浸泡2h→蒸餾水洗至pH為中性→95%乙醇浸泡備用。

1.2.3 雙氧水法單因素實驗和正交實驗 雙氧水法脫色的原理是基于雙氧水在水溶液中電離出的過氧氫根離子HO2-去進攻色素的結(jié)果。實驗中配制10mg/mL的粗多糖溶液，加入30%雙氧水進行脫色。以脫色時間、脫色溫度、溶液的pH和雙氧水用量為單因素條件，測定不同條件下多糖溶液的脫色率，先進行單因素實驗。在單因素實驗基礎(chǔ)上設(shè)計正交實驗，確定最佳脫色工藝，其因素水平表見表1。

表1 雙氧水法脫色正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.2.4 靜態(tài)吸附實驗 稱取一定質(zhì)量預(yù)處理好的AB-8、LS-700B、803、840樹脂放入具塞錐形瓶中，加入一定量的粗多糖供試液，于25℃恒溫水浴振搖24h后，測其吸光度值。計算脫色率、多糖保留率和蛋白脫除率。

1.2.5 樹脂法單因素實驗 稱取一定質(zhì)量預(yù)處理好的AB-8、LS-700B、803樹脂放入具塞錐形瓶中，加入一定量的粗多糖供試液進行脫色，以樹脂類型、脫色溫度、脫色pH為單因素條件，測定不同條件下多糖溶液的脫色率、多糖保留率和蛋白脫除率。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 色素脫色率的計算 將倒卵葉五加多糖溶液于200～600nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)溶液在可見光區(qū)并無吸收峰，但從430～490nm吸收呈現(xiàn)遞減趨勢。本研究在可見光區(qū)430～4900nm波長范圍內(nèi)選擇了430、450、470、490nm這4個波長，分別測定了倒卵葉五加多糖溶液脫色前后的吸光度，發(fā)現(xiàn)測得的脫色率均無顯著性差異，因此本研究選擇脫色率接近平均值的470nm為檢測波長，測定倒卵葉五加多糖溶液脫色前后的吸光度，并按下式計算脫色率。

式中：A前、A后分別為脫色前、后多糖溶液的吸光度值。

1.2.6.2 多糖保留率的計算 多糖含量的測定用苯酚-硫酸法，多糖保留率按下式計算。

式中：M前、M后分別為脫色前后的多糖含量。

1.2.6.3 蛋白脫除率的測定 蛋白質(zhì)的測定采用考馬斯亮藍法[7]。蛋白脫除率按下式計算。

式中，C前、C后分別為倒卵葉五加多糖溶液在脫蛋白前后的蛋白質(zhì)濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙氧水脫色方法的單因素實驗

影響雙氧水法脫色效率的主要因素有脫色時間、脫色溫度、溶液pH和雙氧水的用量等。

2.1.1 脫色時間的影響 固定溶液pH為8.0，脫色溫度為50℃，雙氧水和多糖的體積比為1∶1，考察脫色時間對脫色效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 時間對脫色的影響Fig.1 Effect of time on decoloring rate

由圖1可以看出，隨著脫色時間的增加，雙氧水脫色效果明顯增大，當(dāng)脫色時間達到3h時，脫色率達到最大，此后隨著脫色時間的增加，脫色率提高不明顯。多糖保留率一直隨著脫色時間的增加而下降，這可能是由于多糖與雙氧水發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的原因。實驗中選擇脫色時間為3h。

2.1.2 溶液pH的影響 固定脫色時間為2h，脫色溫度為50℃，雙氧水和多糖的體積比為1∶1，考察溶液pH對脫色效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溶液pH對脫色的影響Fig.2 Effect of pH on decoloring rate

由圖2可以看出，隨著溶液pH的增加，脫色率極大增加，這可能是由于雙氧水在堿性條件下活性大的緣故，在pH為10.0后脫色率基本趨于恒定，說明隨著溶液pH的繼續(xù)增加，其對脫色的影響逐漸減弱，而多糖保留率隨著溶液pH的增加一直呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)溶液pH大于10時，多糖保留率急劇下降，因此實驗中選擇溶液的pH為10.0。

2.1.3 溫度的影響 固定溶液pH為8.0，脫色時間為2h，雙氧水和多糖的體積比為1∶1，考察溫度對脫色效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對脫色的影響Fig.3 Effect of temperature on decoloring rate

由圖3可以看出，脫色率隨著溶液溫度的升高而增加，在溫度達到60℃時脫色率最高，此后隨著溫度的繼續(xù)增加，脫色率有所降低。這可能是由于溫度過高會造成雙氧水分解，不利于脫色。多糖的保留率隨著溫度升高而降低，但其變化比較小，因此實驗中選擇脫色溫度為60℃。

2.1.4 雙氧水用量的影響 固定溶液pH為8.0，脫色時間為2h，脫色溫度為60℃，考察雙氧水用量對脫色效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 雙氧水用量對脫色的影響Fig.4 Effect of the concentration of H2O2on decoloring rate

由圖4可以看出，脫色率隨著體積比的增加而增加，在料液比為1∶1以后變化不大，而多糖保留率隨著液料比的增加而降低，這主要是由于多糖結(jié)構(gòu)中含有羥基等活性基團，雙氧水用量過多，將多糖氧化的緣故，因此雙氧水用量不宜過大，實驗中選擇雙氧水和多糖溶液的液料比為1∶1。

2.2 正交設(shè)計確定最佳脫色工藝

通過正交實驗L9（34）確定倒卵葉五加多糖的最佳脫色工藝。正交實驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表2、表3可以看出，雙氧水法脫色的影響因素大小順序為：C>A>B>D，其中C因素及A因素各水平間有顯著性差異，確定最佳脫色條件為A2B3C2D2，即選取脫色pH為10，脫色溫度為60℃，脫色時間為3h，樣液與試劑的體積比為1∶1，以此組合做驗證實驗得脫色率可達到84.45%，蛋白脫除率為9.66%，多糖的損失率為9.06%。由此可見，雙氧水法具有較高的脫色率和多糖保留率，但蛋白脫除率較低。

表2 雙氧水法脫色L9（34）正交實驗結(jié)果Table 2 Design and results of the orthogonal test

2.3 樹脂的篩選

不同樹脂對多糖的脫色效果見表4。由表4可以看出，4種樹脂中LS-700B樹脂具有較強的脫色能力，較高的蛋白脫除率和多糖保留率。不同樹脂對色素、蛋白質(zhì)和多糖的吸附能力各不相同，一方面與樹脂的性能有很大的關(guān)系，另一方面也與被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。樹脂的脫色原理主要有兩種，一種是基于離子交換機理，即溶液中的離子和樹脂上的離子進行交換，另一種是吸附機理，吸附性能的優(yōu)劣是由其化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)決定的，樹脂的極性和空間結(jié)構(gòu)是影響吸附性能的重要因素。吸附符合極性相似原則，即被吸附物質(zhì)和樹脂的極性相似，吸附能力較強，反之，吸附能力較弱。從樹脂性質(zhì)上看，LS-700B屬于陰離子交換樹脂，AB-8和803屬于大孔吸附樹脂，840屬于陽離子交換樹脂，脫色率LS-700B最好，表明倒卵葉五加粗多糖中的色素可能以有機陰離子色素為主。從樹脂極性看，AB-8是大孔弱極性樹脂，具有疏水性表面結(jié)構(gòu)，通過分子內(nèi)的疏水基與吸附物質(zhì)相互作用而進行吸附。AB-8脫色效果較好，表明倒卵葉五加中的多糖中色素的極性較弱。

表4 不同樹脂對倒卵葉五加多糖溶液脫色效果Table 4 Comparison between decoloring effects of different resin on polysaccharide liquid of Acanthopanax obovatus Hoo

2.4 樹脂脫色工藝條件的確立

以脫色率、多糖保留率和蛋白脫除率為評價指標(biāo)，采用單因素法研究了樹脂脫色的工藝條件，分別研究了樹脂類型、脫色溫度、脫色pH對脫色效果的影響。得到樹脂脫色的工藝條件是：LS-700B樹脂，溫度為45℃，溶液pH為7.0。在該條件下的脫色率達到79.50%，蛋白脫除率達到79.10%，多糖保留率為82.80%。

3 結(jié)論

研究了雙氧水法和樹脂法對多糖中色素脫除率和多糖損失率影響，得到倒卵葉五加多糖的最佳脫色工藝。雙氧水法脫色效率高，多糖的保留率也高。在單因素輪換的基礎(chǔ)上進行了正交實驗，得到倒卵葉五加多糖的最佳工藝為：溶液的pH為10，脫色溫度60℃，脫色時間3h，樣液與試劑的體積比為1∶1，在此條件下，脫色率為84.45%，多糖保留率為90.94%，蛋白脫除率為9.66%，說明雙氧水對蛋白質(zhì)的脫除沒有明顯的效果。樹脂法脫色的工藝條件是LS-700B樹脂，溫度45℃，溶液pH為7.0。在該條件下的脫色率為79.50%，多糖保留率為82.80%，蛋白脫除率為79.10%。對雙氧水法和樹脂法的脫色效果進行比較，可以看出樹脂法的脫色率和多糖保留率都比雙氧水法低，此外，大孔吸附樹脂價格昂貴，種類較多，使用前需要進行樹脂的篩選，操作比較繁瑣。因此，對倒卵葉五加多糖，雙氧水法是一種較好的脫色方法。

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