酶法輔助提取紅松種殼多酚的工藝優(yōu)化研究

黃雨洋，王振宇

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090；3.黑龍江糧食職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150080）

紅松（Pinus koraiensis），亦稱果松、海松。常綠喬木，高達(dá)40m。葉五針一束，長6～12cm。分布于我國東北長白山到小興安嶺地區(qū)，常與魚鱗松、紅皮云杉等組成混交林，是重要的農(nóng)林資源，其果實紅松種子以其顆粒飽滿，營養(yǎng)豐富而聞名，自古就是食療佳品，具有較高的藥用價值及保健功能。研究表明，松屬植物中含有萜類、多酚類、生物堿等多種生物活性成分[1]，具有抗氧化、抗腫瘤及抗菌等生物活性[2-3]。其中多酚類成分是重要的抗氧化劑，具有很大的開發(fā)潛力。在利用食用松仁之后的紅松種殼基本屬于廢棄物，沒有得到充分利用，造成了資源浪費(fèi)。有研究報道，紅松種殼中多酚類成分具有抗氧化活性，可研制新藥用于自由基引發(fā)疾病（心血管病、癌癥等）的防御和治療[4-5]。酶法輔助提取植物活性物質(zhì)是近年來新興的一種有效的提取方法。應(yīng)用該方法對氨基酸、蛋白質(zhì)和黃酮類物質(zhì)、萜類物質(zhì)進(jìn)行提取的研究都有報道[6-8]，但將此方法應(yīng)用到紅松殼多酚提取方面的研究尚未見文獻(xiàn)報道。與傳統(tǒng)提取方法相比，酶法提取具有無毒性、效率高、反應(yīng)條件溫和及催化活力可被調(diào)節(jié)控制等優(yōu)勢[9]。植物組織中的黃酮類物質(zhì)等有效成分大多包裹在細(xì)胞壁中，對這些有效成分的提取，傳統(tǒng)的熱水、酸、堿、有機(jī)溶劑提取法，受細(xì)胞壁主要成分纖維素的阻礙，往往提取效率較低。恰當(dāng)?shù)乩美w維素酶處理這些植物材料，可改變細(xì)胞壁的通透性，提高有效成分的提取[10]。因此，作者采用纖維素酶輔助法對紅松殼中多酚類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了研究。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對酶法提取紅松殼中多酚類物質(zhì)的提取工藝和條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在探索一種在較低溫度下進(jìn)行快速、簡便、最大限度地提取紅松殼中多酚有效成分的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松種子殼 收集于黑龍江省伊春，粉碎后40目過篩，低溫干燥至恒質(zhì)量后備用；纖維素酶（Sanlandchem international Inc，30u/mg）、沒食子酸、福林試劑、碳酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇 國產(chǎn)分析純。

高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器公司；恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療電子儀器廠；酸度計 上海大中分析儀器廠；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計 北京普析通用公司；R-205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝儀器公司；電子天平 西安興成智儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 紅松種殼→40℃條件下烘干→粉碎過40目篩→準(zhǔn)確稱取5.0g松殼粗粉于四頸中加入酶液→在不同酶解條件下（酶解時間、料液比、酶解溫度、加酶量、pH）酶解處理→加入乙醇溶液→水浴振蕩浸提→離心取上清液→測定多酚含量。

1.2.2 Folin-ciocalteu法測定總酚類成分含量

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[8]準(zhǔn)確稱取沒食子酸50mg，先加入少量乙醇，待沒食子酸全部溶解后，加乙醇定容至500mL混合均勻得到濃度為100μg/mL的沒食子酸溶液。量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL置于10mL比色管中，加乙醇定容至2mL，搖勻后加1.0mL福林試劑，4min后加入1.0mL 10%的碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h后測定溶液在765nm處的吸光值（A765），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0534x+0.1529，R2=0.9992，式中，x為多酚含量（mg/g干重），y為吸光度。

1.2.2.2 松殼提取物中總酚含量的測定 準(zhǔn)確吸取適量體積的松殼提取液1mL置于10mL比色管中，加乙醇定容至2mL。加入1.0mL福林試劑后搖勻，4min后加入1.0mL10%碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h后測定溶液在765nm處的吸光度值。將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中多酚類成分含量。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計實驗 分別考察乙醇濃度、酶解時間、液料比、酶解溫度、加酶量、pH對紅松種殼中總酚得率的影響，以確定各因素的適應(yīng)范圍。在單因素實驗基礎(chǔ)上，綜合考慮6個因素對提取物中多酚得率的影響，按SAS9.1對紅松種殼多酚條件進(jìn)行優(yōu)化。因素水平編碼如表1所示。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對多酚得率的影響 設(shè)定液料比25∶1、溫度50℃、pH5.0、加酶量60U/g底物條件下酶解2h，分別選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%，測定多酚得率。由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚得率先增加后減小。在提取乙醇濃度為40%～80%附近，多酚得率有較大值出現(xiàn)。這是因為乙醇濃度為40%～80%溶液中傳質(zhì)阻力較小，而且隨著溶劑的極性逐漸減小，多酚類物質(zhì)的溶解性減小，從而導(dǎo)致多酚得率減小。

圖1 乙醇濃度對多酚得率的影響Fig.1 Enzymatic temperature of polyphenols rate

2.1.2 酶解時間對多酚得率的影響 設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液料比25∶1、溫度50℃、pH5.0、加酶量60U/g條件，分別選取酶解時間1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h，測定多酚含量。由圖2可知，隨著酶解時間的延長，多酚得率先增加后略有下降。在酶解時間2h附近，多酚得率有較大值出現(xiàn)。多酚得率隨酶解時間的增加，先增加后降低，這是因為酶解時間達(dá)到2h時，細(xì)胞壁大部分已經(jīng)被酶解破壞，多數(shù)多酚被溶出，多酚得率最高。

圖2 酶解時間對多酚得率的影響Fig.2 Enzymatic time of polyphenols rate

2.1.3 液料比對多酚得率的影響 設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、溫度50℃、pH5.0、加酶量60U/g條件下酶解2h，分別選取液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1，測定多酚含量。由圖3可知，隨著液料比比值的增加，多酚的得率先增大后略有下降。在液料比為35∶1附近，多酚得率有較大值出現(xiàn)。這是因為隨著料液比的增加，溶劑和紅松殼粉末之間的接觸面增大，從而有利于紅松樹殼多酚得溶出。綜合經(jīng)濟(jì)成本及后續(xù)濃縮處理等因素的考慮，液料比不宜繼續(xù)增加。

圖3 液料比值對多酚得率的影響Fig.3 Liquid to solid ratio of polyphenols rate

2.1.4 溫度對多酚得率的影響 設(shè)定乙醇體積法分?jǐn)?shù)為50%、液料比25∶1、pH5.0、加酶量60U/g，分別選取酶解溫度為20、30、40、50、60、70℃分別酶解2h，測定多酚含量。由圖4可知，隨著酶解溫度的增大，多酚得率先增加后略有降低。在酶解溫度為40～60℃附件，多酚得率有較大值出現(xiàn)。這是因為溫度增加有利于提高酶活，當(dāng)溫度高于50℃會使多酚成分發(fā)生變性或降解，同時酶失活，導(dǎo)致多酚得率下降。

圖4 溫度對多酚得率的影響Fig.4 Temperature of polyphenol rate

2.1.5 pH對多酚得率的影響 設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液料比25∶1、溫度50℃、加酶量60U/g條件下，分別選取酶解pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0酶解2h，測定多酚含量。由圖5可知，隨著pH的增大，多酚得率先增加后下降。在酶解pH為5附近，多酚得率有較大值出現(xiàn)。這是因為纖維素酶的最佳作用pH范圍為3.0～5.0，在此范圍內(nèi)能夠發(fā)揮最大活力，可加速紅松殼中多酚類物質(zhì)的降解，使得多酚化合物的溶出效率提高，過低或過高的pH都會使纖維素酶活力降低，從而使多酚得率減小。

圖5 pH對多酚得率的影響Fig.5 pH of polyphenol rate

2.1.6 酶用量對多酚得率的影響 設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液料比25∶1、溫度50℃、pH5.0，分別選取酶用量為30、60、90、120、150、180、210、240U/g酶解2h，測定多酚含量。由圖6可知，隨著酶用量的增加，多酚得率先增加后不變。當(dāng)酶用量大于120U/g后，多酚得率有較大值出現(xiàn)。這是因為紅松殼多酚中含有大量的纖維素物質(zhì)，它與多酚類物質(zhì)結(jié)合緊密，纖維素酶能促使纖維素解鏈，使更多的多酚物質(zhì)釋放，從而使多酚得率提高，當(dāng)加酶量為120U/g時，多酚得率達(dá)到最佳，酶解進(jìn)行完全，此時繼續(xù)增加加酶量，由于酶的反饋作用，酶解效率反而略有所下降。

圖6 加酶量對多酚得率的影響Fig.6 Polyphenols rate plus the amount of enzyme

2.2 響應(yīng)面法對松殼多酚提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計 以紅松殼多酚得率（y，mg/g）為響應(yīng)值進(jìn)行相應(yīng)分析實驗，Small Composite：Hartley Method設(shè)計每個因素取5個水平，以（-2，-1，0，1，2）編碼，對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值[11-12]。表2中33組實驗為因點和零點，其中析因點位自變量取值在x1、x2、x3、x4、x5、x6所構(gòu)成的三維頂點，零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)5次，用以估計實驗誤差。

表2 實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

2.2.2 回歸方程建立與方差分析 利用SAS9.1軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多酚得率（y）對乙醇濃度（x1）、酶解時間（x2）、料液比（x3）、酶解溫度（x4）、加酶量（x5）、pH（x6）的二次多項回歸模型為：

y=8.523-0.2225x1+0.693x2+0.485x3+0.34x4+0.24x5-0.133x6-0.522x12-0.116x1x2-0.126x1x3+0.121x1x4-0.307x1x5+0.106x1x6-0.309x22-0.234x2x3-0.338x2x4+0.032x2x5+0.387x2x6-0.723x32-0.058x3x4+0.289x3x5+0.009x3x6-0.280x42-0.344x4x5-0.377x4x6-0.138x52+0.086x5x6-0.764x62

表3是對方程的方差和回歸分析結(jié)果。由表3可知，模型一次項的因子貢獻(xiàn)率為x2＞x3＞x4＞x5＞x1＞x6，即單因素對多酚得率的影響大小依次是酶解時間、液料比、酶解溫度、加酶量、乙醇濃度、pH；二次項x12、x22、x32、x42、x62顯著；交互項中x2x4、x2x6、x3x5、x4x5顯著。由表3可知FModel=14.90875，p＜0.01，表明二次多元回歸模型極顯著；p失擬項=0.116485＞0.05，說明模擬失擬不顯著；模型的相關(guān)系數(shù)R2=98.77%，表明方程模型與實驗數(shù)據(jù)有98.77%的符合度，該模型有很高的可信度度，可以用此模型對紅松殼提取多酚的工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 The table of variance analysis

2.2.3 多酚得率的響應(yīng)面法分析 響應(yīng)面分析的圖形是特定的響應(yīng)面對應(yīng)自變量構(gòu)成的一個三維空間圖，可以直觀的反映出各自變量對響應(yīng)值的影響[13]。圖7～圖10為因素交互作用的響應(yīng)面圖。響應(yīng)面是響應(yīng)值對各實驗因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，因素對實驗結(jié)果影響越大，表現(xiàn)為曲面越陡峭[14]。從圖7～圖10中可以看出，4個響應(yīng)面均為開口向下的凸行曲線，說明響應(yīng)值（紅松殼多酚得率）存在極大值。

圖7 酶解溫度、酶解時間對多酚得率的響應(yīng)面圖Fig.7 Hydrolysis temperature and Hydrolysis time enzyme of the polyphenol yield response surface

酶解時間與酶解溫度對紅松殼多酚得率的交互作用見圖7。酶解時間一定時，時間較短時，得率隨著溫度的增加而增加；時間較長時，紅松殼得率隨著溫度的增加先增加后減少。

酶解時間與pH對紅松殼多酚得率的交互作用見圖8。酶解時間一定時，隨著pH的增加，紅松殼多酚得率先增加后減少。

圖8 酶解時間、pH對多酚得率的響應(yīng)面圖Fig.8 Hydrolysis temperature and pH enzyme of the polyphenol yield response surface

液料比與加酶量對紅松殼多酚得率的交互作用見圖9。液料比一定時，隨著加酶量的增加，紅松殼多酚得率先增加后降低。

圖9 液料比、加酶量對多酚得率的響應(yīng)面圖Fig.9 Liquid-solid ratio and the amount of enzyme of the polyphenol yield response surface

酶解溫度與加酶量對紅松殼多酚得率的交互作用見圖10。酶解溫度較低時，得率隨著加酶量的增加而增加；酶解溫度較高時，得率隨酶量的增加先增加后減少。

圖10 酶解溫度、加酶量對多酚得率的響應(yīng)面圖Fig.10 Hydrolysis temperature and The amount of enzyme of the polyphenol yield response surface

2.2.4 實驗驗證與對比實驗 為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，采用響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件（見表4，乙醇濃度61%、酶解時間2h、液料比36∶1、酶解溫度62℃、加酶量106U/g、pH4.6）進(jìn)行提取紅松殼多酚得率驗證實驗。由表5結(jié)果可知，3次驗證實驗結(jié)果所測得的紅松殼多酚得率的平均值為8.93mg/g，在預(yù)測值標(biāo)準(zhǔn)誤差內(nèi)，可見該模型能較好地預(yù)測紅松殼多酚的提取情況，證明此次RSM實驗參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的應(yīng)用價值。

表4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果Table 4 Results of the optimization of response surface

由表5對比實驗結(jié)果可知，在不加酶條件下提取紅松種殼多酚（乙醇濃度61%、酶解時間2h、液料比36∶1、酶解溫度62℃、pH4.6），多酚得率為7.96mg/g，比加酶提取工藝低0.97mg/g。由此可見，在乙醇提取紅松殼多酚工藝中，采用纖維素酶預(yù)先進(jìn)行酶解可以增加多酚得率。

表5 驗證和對比實驗結(jié)果Table 5 Validation test and contrast test results

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，考察了乙醇濃度、酶解時間、料液比、酶解溫度、加酶量、pH對紅松殼多酚得率的影響。由響應(yīng)面分析實驗得出，酶解時間、料液比、酶解溫度、乙醇濃度是影響紅松殼多酚得率的主要因素，其中酶解時間的影響最為顯著。依據(jù)回歸分析確定紅松殼多酚提取的最佳工藝為乙醇濃度61%、酶解時間2h、液料比36∶1、酶解溫度62℃、加酶量106U/g、pH4.6。在此工藝條件下，紅松殼多酚得率可達(dá)8.93mg/g。由驗證實驗結(jié)果可見，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化紅松殼多酚的提取工藝條件在實踐上是可靠的。根據(jù)對比實驗可知，在乙醇提取紅松殼多酚工藝中，采用纖維素酶預(yù)先進(jìn)行酶解可以增加多酚得率，增加量為0.97mg/g。而且，酶法輔助提取紅松種殼多酚具有條件簡便、反應(yīng)時間短、反映條件溫和、成本低、效率高等特點，具有一定的研究價值。

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