槐角黃酮的體外抗氧化活性研究

陳明珠，申艷艷，趙 越，秦 偉，何杰宇，許 茜

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009）

中藥槐角系豆科植物槐（Sophora jonica L.）的干燥成熟果實(shí)，莢果，圓柱形，有時彎曲，形狀似角，故謂之“角”[1]?；苯蔷哂星鍩釣a火、涼血止血的功效，為《中華人民共和國藥典》歷版收載品種?；苯侵泻卸喾N多樣的化學(xué)成分，如黃酮類化合物、生物堿、三萜皂苷類化合物、磷脂類化合物及多種氨基酸等，其中以黃酮類化合物含量尤其突出，是槐角的主要活性成分[2]。自由基能夠攻擊細(xì)胞組織中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類和DNA等物質(zhì)，造成脂質(zhì)和糖類的氧化、蛋白質(zhì)的變性、酶的失活、DNA的變性等多種改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜、遺傳因子等的損傷，進(jìn)而引發(fā)多種疾病、癌變和老化等[3-5]。傳統(tǒng)合成抗氧化劑BHT、BHA、PG雖具有很好的抗氧化性，但其安全性受到質(zhì)疑。因此開發(fā)利用天然抗氧化劑的要求日益迫切。我國傳統(tǒng)中藥材富含天然抗氧化劑，不同藥材中所含的抗氧化活性成分不同，抗氧化的作用情況也不盡相同。其中黃酮類化合物已被證實(shí)具有較強(qiáng)的清除氧自由基的能力，是一類極具開發(fā)前景的天然有效抗氧化劑[6-8]。槐角中黃酮類化合物多與糖結(jié)合以苷類形式存在。目前從槐角中分離得到的黃酮化合物包括七種苷元：山柰酚、槲皮素、異鼠李素、楊梅素、芹菜素、木犀草素和三粒小麥黃酮。其中前兩種含量最多，是槐角的主要藥理成分[9]。然而，遺憾的是，槐角中黃酮化合物的抗氧化功效研究尚未見報(bào)道。本文以VC作為陽性對照，研究槐角黃酮對DPPH·、O2-·和·OH等三種自由基的清除能力，并研究其抗氧化作用，以期為槐角的保健功能和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

槐角 徐州天力生化制品有限公司提供，粉碎后備用；抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、鄰菲羅啉、鄰苯三酚、雙氧水、硫酸亞鐵、甲醇、乙醇、乙腈、磷酸、鹽酸 均為分析純；水 重蒸水。

AL204電子天平 瑞士梅特勒；UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本島津；高速萬能粉碎機(jī) 天津華鑫；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇榮華；SB-50D超聲波清洗機(jī) 寧波新芝；PHS-25數(shù)顯PH計(jì) 合肥遠(yuǎn)中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 槐角黃酮的制備 選用傳統(tǒng)的回流提取法對槐角中黃酮類化合物進(jìn)行提取。根據(jù)前期響應(yīng)面分析法確定槐角黃酮的提取條件為：乙醇濃度74%，液料比18mL/g，提取時間為2h，提取溫度為90℃。

將槐角粉碎，準(zhǔn)確稱取5.0g槐角粉末于150mL具塞錐形瓶中，加入90mL 74%乙醇，90℃加熱回流提取2h后，得槐角黃酮提取液。測得提取液中槐角黃酮的提取率為10.461%，根據(jù)提取液體積換算成槐角黃酮的質(zhì)量濃度，以水稀釋制得黃酮含量約為1mg/mL的溶液供試。

1.2.2 清除DPPH自由基能力的測定[10]分別吸取一定體積VC（1mg/mL）、槐角黃酮至10mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，在10mL比色管中加入DPPH溶液（0.2mmol/L）2mL，各濃度樣液2mL，搖勻，室溫避光靜置30min，在517nm處測量吸光度Ai；用2mL無水乙醇代替樣液，在517nm處測得吸光度A0；用2mL無水乙醇代替DPPH·溶液，在517nm處測得吸光度Aj。每一吸光度平行測定3次，取平均值。測出A0、Ai、Aj所表示樣品的吸光度值，清除率按公式（1）計(jì)算。

清除率S（%）=（A0-Ai+Aj）/A0×100 式（1）

1.2.3 超清除氧陰離子能力的測定[11]鄰苯三酚自氧化速率的測定：取4.5mL pH=8.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖液，4.2mL蒸餾水，混勻后在25℃恒溫水浴中溫育20min，取出迅速冷卻后立即加入在25℃預(yù)熱過的3mmol/L鄰苯三酚溶液0.3mL，空白管用10mmol/L HCl。每隔0.5min在325nm處測定溶液的吸光度，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值△A0。

加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率測定：加入鄰苯三酚前，先分別加入不同濃度的樣品（槐角黃酮和VC）溶液lmL，蒸餾水3.2mL，然后按上文的方法操作，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值△A。清除率的計(jì)算如公式（2）所示。

清除率（%）=[（△A0-△A）/△A0]×100 式（2）

式中，△A0——鄰苯三酚自氧化速率；△A——加入樣品后鄰苯三酚的自氧化速率。

1.2.4 清除羥基自由基（·OH）能力的測定[12]取0.75mmol·L-1鄰二氮菲溶液1mL，PBS溶液2mL和蒸餾水1mL，充分混勻后，加0.75mmol/L硫酸亞鐵1mL混勻，加0.01%的過氧化氫1mL，于37℃水浴溫育60min后在536nm處測其吸光度，所得數(shù)據(jù)為損傷管的吸光值A(chǔ)（損）；1mL蒸餾水代替1mL過氧化氫，于536nm處測得吸光度為A（未）；用試樣（槐角黃酮提取液和VC）1mL代替lmL蒸餾水，于536nm處測得吸光度為A（樣），計(jì)算方法如公式（3）所示。

·OH清除率（%）=[A（樣）-A（損）]/[A（未）-A（損）]×100式（3）

2 結(jié)果與討論

2.1 清除DPPH自由基能力

槐角黃酮和VC對DPPH自由基的清除作用分別如圖1、圖2所示。結(jié)果表明，槐角黃酮與VC在一定的濃度范圍內(nèi)對DPPH呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，在抗氧化劑濃度較低時，清除率迅速上升，抗氧化劑濃度與清除率之間接近線性關(guān)系；當(dāng)清除率接近極大值時，繼續(xù)提高抗氧化劑濃度，其清除率上升十分緩慢?；苯屈S酮、VC濃度與清除率之間線性方程分別為：槐角黃酮：Y=2268X+6.089（R2=0.989），線性范圍：0.001～0.040mg/mL；VC：Y=9934X+0.379（R2=0.997），線性范圍：0.001～0.080mg/mL。

樣品清除自由基能力以半數(shù)抑制濃度（IC50）來比較，其定義為：使自由基數(shù)目減少50%時所需要樣品的濃度。經(jīng)計(jì)算，槐角黃酮、VC的IC50分別為0.0192、0.005mg/mL，即，槐角黃酮對DPPH自由基的清除能力弱于VC。

圖1 槐角黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.1 The scavenging effect of the flavonoids fromfructus sophorae on DPPH·

圖2 VC對DPPH自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of VCon DPPH·

2.2 清除超氧陰離子自由基能力

以鄰苯三酚反應(yīng)體系的吸光度A值對反應(yīng)時間t所作的線性關(guān)系圖，由此得到鄰苯三酚自氧化速率△A0=0.063（即線性圖中的斜率）。同樣方法得到加入不同濃度抗氧化劑的氧化速率，從而計(jì)算出各自的清除率?；苯屈S酮、VC對超氧陰離子自由基的清除作用分別如圖3、圖4所示。由圖3、圖4中可見，槐角黃酮、VC對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基均有較強(qiáng)的清除能力。隨著樣品濃度的升高，清除率迅速上升，在一定濃度范圍內(nèi)抗氧化劑濃度與清除率之間接近線性關(guān)系。清除作用的線性方程分別表示如下：槐角黃酮：Y=2392X+19.64（R2=0.987），線性范圍：0.003～0.030mg/mL；VC：Y=1877X+1.285（R2=0.990），線性范圍：0.005～0.050mg/mL。計(jì)算得槐角黃酮和VC的IC50分別為0.0127、0.0260mg/mL，因此與VC相比，槐角黃酮清除超氧陰離子自由基的能力更強(qiáng)。

圖3 槐角黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3 The scavenging effect of the flavonoids from fructus sophorae on O2-·

圖4 VC對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.4 The scavenging effect of VCon O2-·

2.3 清除羥基自由基能力

槐角黃酮、VC對·OH的清除作用如圖5、圖6所示。由圖可知，同樣，隨著樣品濃度的升高，清除率迅速上升，抗氧化劑濃度與清除率之間接近線性關(guān)系。對·OH清除作用的線性方程分別表示如下，槐角黃酮：Y=3158X-0.763（R2=0.998），線性范圍：0.0025～0.0275mg/mL；VC：Y=1451X+1.956（R2=0.996），線性范圍：0.005～0.060mg/mL?；苯屈S酮和VC的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.0160、0.0332mg/mL，可見槐角黃酮對羥基自由基的清除能力比VC更強(qiáng)。

圖5 槐角黃酮對羥基自由基的清除作用Fig.5 The scavenging effect of the flavonoids from fructus sophorae on·OH

圖6 VC對羥基自由基的清除作用Fig.6 The scavenging effect of VCon·OH

3 結(jié)論

考察槐角提取液中的黃酮對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等的清除能力，是研究其抗氧化性能的一種簡便有效的方法。研究結(jié)果均表明，在一定槐角黃酮劑量范圍內(nèi)，清除自由基能力與劑量存在量效關(guān)系。隨著添加黃酮量的增加，對自由基的清除能力也在逐漸增強(qiáng)。VC作為經(jīng)常使用的抗氧化劑，已經(jīng)被廣泛使用?；苯翘崛∥镏械狞S酮類化合物對超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除能力均比VC強(qiáng)，提示槐角黃酮是一種極具潛力的天然抗氧化劑。

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