PP2可增強乳腺癌Hs578T細胞縫隙連接功能

董淑英，鄭 超，蔣國君，韓 溪，童旭輝

(蚌埠醫(yī)學院藥學系藥理學教研室，安徽蚌埠 233030）

縫隙連接(gap junction)是細胞間進行物質交流的主要通道，由特殊的通道蛋白——連接蛋白(connexin)組成?？p隙連接功能改變與腫瘤等多種疾病密切相關。研究表明，與正常乳腺細胞相比，乳腺癌細胞中縫隙連接功能有不同程度的降低或缺失，并且恢復或增強縫隙連接功能可能對化療藥物的抗腫瘤作用具有增效作用。

Src激酶是由原癌基因src編碼的非受體型酪氨酸激酶。研究表明，Src在多種腫瘤細胞及組織中過表達，如乳腺癌、肺癌、結腸癌等。Src激酶可以降低細胞的縫隙連接功能，而PP2作為Src激酶的特異性抑制劑，對乳腺癌細胞縫隙連接功能的影響尚不清楚。本課題組前期研究結果表明，乳腺癌細胞株Hs578T中Cx43總蛋白表達水平、細胞膜上Cx43的表達能較好反映藥物對乳腺癌縫隙連接功能的改變，因此本實驗通過Western blot及熒光示蹤法研究了Src激酶抑制劑PP2對Hs578T細胞Src激酶表達及縫隙連接功能的影響，以期為提高化學藥物的抗腫瘤療效提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 Hs578T細胞系購于中科院上海細胞庫。胰蛋白酶、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、PP2均為美國Sigma公司產品;高糖型DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清均為Gibco公司產品;熒光染料 Calcein-AM為 Molecular Probes公司產品。其他常用試劑均為國產分析純級。

1.2 細胞培養(yǎng) Hs578T細胞接種于含有10%(V/V)新生小牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、含體積分數(shù)5% 二氧化碳以及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，1周傳代2～3 次，傳代比例為1∶2。

1.3 MTT法測定 Hs578T細胞的生長 將Hs578T細胞接種于96孔板細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細胞密度為5000個/孔。每組藥物濃度設5個復孔，PP2終濃度為:1、2、4、8、16、32 μmol/L。加藥24 h(藥物作用終點時間)終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前4 h，每孔加MTT 15μl(5 g/L)，棄上清液，加入二甲基亞砜 150μl/孔，微量振蕩器震搖10 min，全自動定量繪圖酶標儀測定每孔的570 nm波長處吸光度值。以上實驗重復3次。細胞存活率按下述公式計算。

1.4 Western blot法檢測Src激酶表達水平將Hs578T細胞按每孔2 ml(細胞密度為1×10個/L)接種于6孔板，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待細胞融合后，用不同濃度的PP2處理24 h和用 8 μmol/L PP2 處理 6 h、12 h、24 h。加藥后24 h，采用細胞全蛋白抽提試劑盒提取細胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定所提取蛋白濃度。取蛋白150μg/組，12%SDS-PAGE凝膠電泳(80 V，30 min;120V，150 min);轉膜(50 V，180 min);5%脫脂牛奶室溫封閉過夜;一抗1∶4000稀釋，4℃孵育過夜;TPBS洗滌3次×10 min;二抗1∶4000稀釋，室溫孵育2 h;TPBS洗滌3次 ×10 min，PBS洗滌1次 ×15 min;ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。對Western blot結果中各條帶進行灰度值掃描，取4次實驗結果的平均值，按正常對照組的Src激酶與其相應的β-actin的比值進行標化計算(即設定正常對照組的Src激酶與其相應的β-actin的比值為1)。

1.5 熒光示蹤法測定細胞間縫隙連接功能

將Hs578T細胞按每孔1 ml(細胞密度為1×10個/L)接種于12孔板，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待細胞融合后，用不同濃度的PP2處理24 h 和用 8 μmol/L PP2 處理 6 h、12 h、24 h。加藥24 h后，將 Hs578T細胞與熒光指示劑calcein-AM共同孵育，使calcein-AM進入細胞。該細胞稱為“供體細胞”。將“供體細胞”接種到已生長融合的Hs578T細胞(“接受細胞”)上，培養(yǎng)4 h。待形成穩(wěn)定的縫隙連接后，小分子的calcein(發(fā)綠色熒光)可以通過縫隙連接進入相鄰的“接受細胞”，用熒光顯微鏡觀察，記錄縫隙連接熒光傳遞功能。一個“供體細胞”周圍含有calcein的“接受細胞”數(shù)目作為縫隙連接功能的指標。取5次實驗結果的平均值，按正常對照組的細胞熒光傳遞的結果進行標化(即設定正常對照組“供體細胞”周圍的“接受細胞”的數(shù)量為1)。

2 結果

2.1 PP2對Hs578T細胞生長增殖的影響 先采用MTT法檢測0～32 μmol/L濃度下PP2對Hs578T細胞的生長抑制作用。結果顯示，在1～8 μmol/L的濃度范圍內，PP2作用 Hs578T細胞24 h后，細胞存活率為(98±3)% ～(94±4)%，與未用藥組(PP2為0 μmol/L)無明顯差異(P＞0.05)，表明其對細胞增殖幾無影響;而16、32 μmol/L PP2(超過 8 μmol/L 濃度范圍)作用Hs578T細胞24 h后，其細胞存活率分別為(84±3)%和(75±4)%，與未用藥組(PP2為0 μmol/L)比較，細胞存活率明顯降低(P＜0.01)，表明該濃度范圍的PP2對細胞增殖有明抑制作用(圖1)。因此，實驗中選取了對細胞增殖無明顯影響劑量范圍(1～8 μmol/L)的PP2，觀察其對細胞縫隙連接功能的影響。

圖1 不同濃度PP2對乳腺癌Hs578T細胞存活的影響(n=3)Fig.1 Effect of PP2 on survival of breast cancer cell Hs578T(n=3)

2.2 PP2增強Hs578T細胞縫隙連接功能 細胞熒光示蹤結果顯示，PP2(1～8 μmol/L)作用Hs578T細胞24 h可以增強縫隙連接介導的細胞間熒光傳遞功能(圖 2)。1、2、4、8 μmol/L PP2作用后細胞的標化熒光傳遞強度分別為1.60 ±0.08、2.00 ±0.05、2.20 ±0.05、2.70 ±0.09，與對照組差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01);且高濃度PP2組與低濃度PP2組差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.01)。結果提示，1～8 μmol/L濃度范圍內的PP2隨著用藥濃度增高，其對Hs578T細胞縫隙連接功能的增強作用更加明顯。

圖3顯示，8 μmol/L PP2預處理 Hs578T細胞6 h、12 h、24 h后，可以增強縫隙連接介導的細胞間熒光傳遞功能。PP2預處理不同時間后細胞標化熒光傳遞強度分別為1.4±0.05、1.7 ±0.06 及2.2 ±0.07，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);且PP2長時間作用與短時間作用差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結果提示，6～24 h的時間范圍內，長作用時間8 μmol/L PP2對Hs578T細胞的縫隙連接功能的作用更明顯。

2.3 PP2減少Hs578T細胞Src激酶的表達用1 ～ 8 μmol/L PP2處理Hs578T細胞24 h，可見 Src激酶表達均減少(圖 4)。1、2、4、8 μmol/L PP2作用后Hs578T細胞Src激酶表達與 β-actin 比值分別為 0.93 ±0.02、0.70 ±0.09、0.66 ±0.09、0.36 ±0.10，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.01);且高濃度PP2組與低濃度PP2組比較，其差異亦均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05～0.01)。

圖4 不同濃度PP2作用后乳腺癌細胞Hs578T Src激酶表達 Western blot法檢測結果Fig.4 Effect of PP2 with different concentrations on the expression of Src kinase of breast cancer cell Hs578T

進一步觀察8 μmol/L PP2預處理Hs578T細胞不同時間對Src激酶表達的影響。結果顯示，用8 μmol/L 預處理Hs578T 細胞6 h、12 h 和24 h，可以減少Src激酶表達(圖5)。8 μmol/L PP2作用細胞6、12、24 h后，其Src激酶表達與β-actin 比值分別為 0.82 ±0.03、0.66 ±0.08、0.59±0.09，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);且PP2長時間作用與短時間作用后差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.01)。

圖5 8 μmol/L PP2作用不同時間后乳腺癌細胞 Hs578TSrc激酶表達Western blot法檢測結果Fig.5 Effect of PP2 with 8 μmol/L on the expression of Src kinase in breast cancercells Hs578T fordifferent duration

3 討論

在腫瘤細胞中，縫隙連接功能增強對于抗腫瘤藥物具有一定的增效作用，而Src激酶對縫隙連接功能則有抑制作用。本研究探討了Src激酶的強選擇性抑制劑PP2對乳腺癌細胞Hs578T的縫隙連接功能的影響及可能機制。對縫隙連接功能的研究常用的方法是劃痕法，但此法只可進行定性研究，而熒光示蹤法則可對縫隙連接功能進行較為準確的定量研究，所以本研究采用熒光示蹤法研究了 Src激酶抑制劑PP2對Hs578T細胞中縫隙連接功能的影響，并采用Western blotting法檢測Src激酶的表達情況以探討其可能機制。為篩選出本身對腫瘤細胞生長增殖無明顯影響的PP2的濃度，為后續(xù)通過增強縫隙連接功能而增敏抗腫瘤藥的抗腫瘤作用研究提供依據，先觀察了PP2對乳腺癌Hs578T細胞生長曲線的影響。結果表明，PP2濃度在1～8 μmol/L時，對于乳腺癌細胞生長幾無影響。進一步的研究發(fā)現(xiàn)該濃度范圍的PP2可以顯著增強Hs578T細胞的縫隙連接功能，同時顯著降低Hs578T細胞中Src激酶的表達，因此可以推測 PP2對Hs578T細胞的縫隙連接功能的增強作用可能與其降低Hs578T細胞中Src激酶的表達有關。

目前認為Src激酶可以通過以下幾種途徑來影響細胞的縫隙連接功能:(1)影響作用于縫隙連接通道功能的蛋白質的表達;(2)作用于蛋白激酶C(PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等，進而使連接蛋白磷酸化，抑制縫隙連接通道功能;(3)直接磷酸化連接蛋白連接蛋白43。(4)Src通過下游的 Cas阻斷縫隙連接功能。本研究Western blot結果提示，PP2可能通過直接抑制Src激酶的表達來間接調控Hs578T細胞之間的縫隙連接功能，但Src激酶調控縫隙連接功能的具體機制尚有待探討。

文獻報道，縫隙連接能顯著增強順鉑的細胞毒性;此外，縫隙連接功能增強時也可促進依托泊苷引起的成膠質瘤細胞凋亡。Kashiwagi報道，Src 激酶抑制劑 Su6656 可以顯著增強順鉑在H28細胞中的細胞毒性。PP2是一種強選擇性的Src激酶抑制劑，本研究結果表明:PP2在乳腺癌細胞中可以顯著增強細胞的縫隙連接功能。因此我們推測，作為Src激酶的特異性抑制劑PP2可能會通過增強縫隙連接功能而增強化學藥物的抗乳腺癌作用，該研究將為乳腺癌的治療提供一個新的思路。

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