急性心肌梗死后TGF-β1/Smad3通路的表達(dá)及活血化瘀中藥的干預(yù)

趙海濱,張秀靜,王 帥,郭 夢(mèng),馬 迪,許曉英

(北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京100029)

急性心肌梗死(AMI)后的心肌重塑與心臟破裂、室壁瘤形成及心力衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥密切相關(guān),在AMI死亡率及預(yù)后中起至關(guān)重要的作用[1]。根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明:TGF-β1/Smads信號(hào)通路的過(guò)度激活在誘發(fā)并加重AMI后心肌重塑病理過(guò)程中居關(guān)鍵地位[2]。活血化瘀法以中醫(yī)“祛瘀血、生新血”為理論基礎(chǔ),對(duì)AMI后心肌重塑療效肯定,本課題組通過(guò)研究活血化瘀中藥對(duì)TGF-β1/Smad3通路的影響,探討活血化瘀法對(duì)急性心梗后心肌重塑的效應(yīng)機(jī)制,為活血化瘀法治療急性心梗后心肌重塑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

成年清潔級(jí)Wistar大鼠50只,體質(zhì)量(250±10)g,由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證明:0240574;試劑用藥血塞通軟膠囊由昆明圣火制藥有限責(zé)任公司提供,批號(hào):Z19990022;AMD3100(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1受體阻斷劑),由北京啟維益成科技有限公司提供,批號(hào):239820-5MG;總RNA試劑提取盒由康為世紀(jì)提供;5×SYBRGreen PCRMaster Mix為AB Applied Biosystems公司產(chǎn)品,dNTP為Solarbio公司產(chǎn)品,OligodT、Rnasin、M-MLA 為 promega公司產(chǎn)品,引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成;采用AgilentTechnologiesstratagene M×3 000 P熒光定量?jī)x。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型制作 用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組、活血化瘀組、AMD3100組,每組10只,分籠飼養(yǎng)。

模型組:參照文獻(xiàn)[3-4]制備AMI大鼠模型,鹽酸戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,經(jīng)口氣管插管行小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸,有氧正壓通氣,潮氣量5～6 mL,呼吸比1∶2,呼吸頻率80次/min。連接標(biāo)準(zhǔn)12導(dǎo)聯(lián),記錄大鼠心電圖。經(jīng)左前胸廓旁第3,4肋間逐層開(kāi)胸,暴露心臟,分離心包,在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳交界處用5～0號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)近端制成心肌梗死模型,以心電圖出現(xiàn)壞死性Q波判斷為可能心肌梗死,若無(wú)病理性Q波,則再次結(jié)扎,以提高心肌梗死模型成功率,然后逐層縫合心腔,術(shù)后常規(guī)抗感染治療。

活血化瘀組:制備AMI大鼠模型,術(shù)后立即灌胃給藥,給藥量按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》所示劑量換算法計(jì)算[5]:200 g大鼠計(jì)量(g/kg)=人的劑量1g/(kg·d)×0.018。每天灌胃1次,共用7 d。

AMD3100組:制備AMI大鼠模型,第6天腹腔注射AMD3100(5 mg/kg),余同模型組大鼠。

假手術(shù)組:大鼠經(jīng)歷上述手術(shù)過(guò)程,絲線從冠狀動(dòng)脈下穿過(guò)但不結(jié)扎。

正常組:不做造模處理。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達(dá)水平 1)心肌組織總RNA的提取,心腔內(nèi)注射10%氯化鉀使心臟停跳于舒張期,迅速取下心臟,去除心房大血管及心臟外結(jié)締組織,沖洗干凈,分別置于液氮中保存。余下左室用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋。在冰塊上切取50～100 mg的心肌組織塊,采用試劑盒提取組織的總RNA,操作按說(shuō)明進(jìn)行。A260/A280=1.8～2.0,并計(jì)算出RNA含量。2)cDNA的合成,RNA樣品取10 μ g,依次加入 5 ×RT buffer 5μ L,Olig o(dT)1 μ L,NTP 1 μ L,RNA sin 1 μ L,M-MLA 反轉(zhuǎn)錄酶1 μ L,無(wú) RNase 水補(bǔ)足至總體積 25 μ L。反應(yīng)條件:42 ℃1 h;95 ℃15 min,4℃10 min。得RT終溶液即為cDNA溶液。3)實(shí)時(shí)定量PCR,每種組織均以TGF-β1mRNA 和β-actin基因引物進(jìn)行定量PCR反應(yīng),每管設(shè)3個(gè)復(fù)孔,在96孔PCR板中進(jìn)行。TGF-β1引物序列:上游引物5’-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA-3’,下游引物 5’-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3’,產(chǎn)物 143 bp。Smad3上游引物 5’-GTCAACAAGTGGTGGCGTGT G-3’,下游引物5’-GCAGCAAAGGCTTCTGGGATAA-3’,產(chǎn)物 150 bp。內(nèi)參 β-actin引物序列:上游引物 5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’, 下游引物 5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’,產(chǎn)物150 bp。反應(yīng)條件:95 ℃,10 s;95℃,30 s;55℃,30 s,共40個(gè)循環(huán)。每一例樣本反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算并讀出定量結(jié)果Ct值,Ct值采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。

2.3 病理形態(tài)學(xué)檢查 于上述各組處死大鼠,取心肌組織,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片HE染色。常規(guī)HE染色在光鏡下進(jìn)行病理觀察。

2.4 非梗死區(qū)膠原蛋白測(cè)定 采用Mallory’s Trichrome染色法測(cè)定非梗死區(qū)膠原含量,心肌呈紅色,膠原呈藍(lán)色。顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取8個(gè)非血管區(qū)視野,應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖象分析軟件IPWin32采圖系統(tǒng)進(jìn)行圖片采集,計(jì)算機(jī)圖象分析軟件Imageproplus 6.0以相對(duì)著色面積進(jìn)行定量分析,取8個(gè)視野的平均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用單因素方差分析t檢驗(yàn)。所得數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 心肌組織病理學(xué)觀察 HE染色結(jié)果顯示,正常組大鼠心臟組織切片,心肌細(xì)胞為短柱狀,每個(gè)心肌細(xì)胞有個(gè)圓形的核,位于細(xì)胞中央呈藍(lán)色,有的細(xì)胞為雙核結(jié)構(gòu);細(xì)胞核的兩端肌漿較多,細(xì)胞質(zhì)呈紅色;心肌細(xì)胞有分枝,彼此相連成網(wǎng),排列緊密;心肌細(xì)胞分層或分成許多束,且在心肌層或心肌束之間,有結(jié)締組織和毛細(xì)血管,有呈紅色的血細(xì)胞分布;整體呈現(xiàn)正常心肌膜組織。

假手術(shù)組大鼠心臟組織切片,心肌細(xì)胞為短柱狀,每個(gè)心肌細(xì)胞有個(gè)圓形的核,位于細(xì)胞中央呈藍(lán)色,有的細(xì)胞為雙核結(jié)構(gòu);細(xì)胞核的兩端肌漿較多,細(xì)胞質(zhì)呈紅色;心肌細(xì)胞有分枝,彼此相連成網(wǎng),排列緊密;心肌細(xì)胞分層或分成許多束,在心肌層或心肌束之間,有結(jié)締組織和毛細(xì)血管,有呈紅色的血細(xì)胞分布;有成纖維細(xì)胞排列存在,其核圓形或桿狀呈藍(lán)色;整體呈現(xiàn)正常心肌膜組織。

模型組大鼠心臟組織切片,心肌細(xì)胞為短柱狀或圓形且個(gè)大,數(shù)量較少且散在;每個(gè)心肌細(xì)胞有個(gè)圓形的核,位于細(xì)胞中央或邊沿呈藍(lán)色,有的細(xì)胞為雙核結(jié)構(gòu);細(xì)胞核的兩端或周圍肌漿較多,細(xì)胞質(zhì)呈紅色。結(jié)締組織整片廣布,炎性細(xì)胞聚集,核大圓形藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)較少;成纖維細(xì)胞多,扁平狀結(jié)構(gòu),核扁卵圓形藍(lán)色,胞質(zhì)呈粉紅色;淺粉紅色膠原成分較多;小動(dòng)脈個(gè)大,內(nèi)皮及平滑肌形態(tài)清晰;可見(jiàn)毛細(xì)血管和淋巴管結(jié)構(gòu)。整體呈現(xiàn)心肌梗死(重癥)心肌膜組織。

活血化瘀組大鼠心臟組織切片,心肌細(xì)胞為短柱狀,每個(gè)心肌細(xì)胞有個(gè)圓形的核,位于細(xì)胞中央呈藍(lán)色,有的細(xì)胞為雙核結(jié)構(gòu);細(xì)胞核的兩端肌漿較多,細(xì)胞質(zhì)呈紅色;心肌細(xì)胞有分枝,彼此相連成網(wǎng),排列疏松。心肌細(xì)胞間有大量炎性細(xì)胞聚集,核大圓形藍(lán)色,胞質(zhì)少;心肌細(xì)胞間還有少量成纖維細(xì)胞散在,扁平狀結(jié)構(gòu),核扁卵圓形藍(lán)色,胞質(zhì)呈粉紅色。整體呈現(xiàn)心肌炎心肌膜組織。

AMD3100組大鼠心臟組織切片,心肌細(xì)胞為短柱狀,每個(gè)心肌細(xì)胞有個(gè)圓形的核,位于細(xì)胞中央呈藍(lán)色,有的細(xì)胞為雙核結(jié)構(gòu);細(xì)胞核的兩端肌漿較多,細(xì)胞質(zhì)呈紅色;心肌細(xì)胞有分枝,彼此相連成網(wǎng),排列疏松,心肌細(xì)胞間結(jié)締組織充斥且與整片結(jié)締組織相連。有結(jié)締組織整片占據(jù)切片較大區(qū)域,炎性細(xì)胞散在,核大圓形藍(lán)色,胞質(zhì)少;成纖維細(xì)胞多,扁平狀結(jié)構(gòu),核扁卵圓形藍(lán)色,胞質(zhì)呈粉紅色;淺粉紅色膠原成分較多;紅細(xì)胞聚集且多。整體呈現(xiàn)心肌梗死(輕癥)心肌膜組織。

3.2 非梗死區(qū)膠原蛋白測(cè)定 結(jié)果顯示:模型組與假手術(shù)組相比較,非梗死區(qū)膠原沉積明顯(P<0.05),活血化瘀組與模型組相比較膠原沉積降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組非梗死區(qū)膠原蛋白測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)

表1 各組非梗死區(qū)膠原蛋白測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)

注:與假手術(shù)組比較,△P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

組 別 膠原蛋白含量/%假手術(shù)組 3.42±0.47模型組 6.03±0.54△活血化瘀組 5.10±0.36#AMD3100組 5.06±0.27#

3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 結(jié)果顯示:模型組與假手術(shù)組相比,TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)?；钛鼋M較模型組TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達(dá)有所降低(P<0.05)。活血化瘀組與AMD3100組相比較 TGF-β1mRNA、Smad3mRNA 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3mRNA實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果(±s,n=10)

表2 各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3mRNA實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果(±s,n=10)

注:與假手術(shù)組比較,△P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

組 別 TGF-β1 Smad3假手術(shù)組 0.86±0.03 0.43±0.07模型組 1.12±0.12△ 1.07±0.13△活血化瘀組 0.97±0.06# 0.86±0.11#AMD3100組 0.95±0.01# 0.82±0.02#

4 討論

西醫(yī)學(xué)治療AMI后心肌重塑,主要使用粒細(xì)胞集落刺激因子、AMD3100、粒巨細(xì)胞集落刺激因子等作為心肌梗死后干細(xì)胞“歸巢”的有效動(dòng)員劑,相關(guān)研究表明治療AMI后心肌受損的有效性確切。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)AMD3100治療AMI后心肌受損的有效性。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,心肌梗死屬中醫(yī)“胸痹”“真心痛”的范疇,表現(xiàn)為本虛標(biāo)實(shí)[6],是血道閉塞,血脈不通,瘀血滯塞脈絡(luò)所致,以“血?dú)獠恢痢薄把涣鳌薄把鰷恍小钡葹橹饕±頇C(jī)制,以胸悶胸痛、心悸氣短等為主要癥狀。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)祛瘀生新法對(duì)大鼠急性心梗后心肌重塑的作用及對(duì)TGF-β1/Smads通路的干預(yù)發(fā)現(xiàn),祛瘀生新組較模型組TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達(dá)有所降低(P<0.05),而Smad7mRNA表達(dá)增加(P<0.05),膠原含量明顯降低(P<0.05),心肌組織損傷也有所減輕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)中醫(yī)祛瘀生新法對(duì)急性心梗后心肌重塑有一定抑制作用,這為防治心肌梗死后心肌重塑的中醫(yī)藥治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果表明:TGF-β1/Smads通路作為關(guān)鍵調(diào)控因子參與心肌梗死后的心肌重塑過(guò)程,祛瘀生新中藥可能通過(guò)對(duì)其表達(dá)的活化調(diào)控,從而有效改善心肌梗死后的心肌重塑。其作用機(jī)制可能是:祛瘀生新中藥對(duì)TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用,同時(shí)增加Smad7mRNA的表達(dá)。至于祛瘀生新法是否還有其他的活化調(diào)控機(jī)制,還有待進(jìn)一步深入研究。

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