電針“百會”“足三里”穴對慢性內(nèi)臟痛模型大鼠行為及組織中5-HT水平的影響

楊 帥,任曉暄,趙雅芳,郭孟瑋,陳 磊,孫 潔,楊佳敏,張 玲,申松希,朱文蓮,張露芬＊

(1.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,北京100029;2.北京小湯山醫(yī)院康復科,北京102211)

慢性內(nèi)臟痛是臨床常見癥狀,由于疼痛定位模糊,疼痛感覺強烈,痛閾較高等特點,往往會伴有強烈的情緒心理障礙[1]。文獻顯示,針灸不僅能緩解各種病理性疼痛,還能明顯改善情緒心理行為變化[2]。腸易激綜合征(IBS)模型又被認為可作為臨床實驗研究的一種典型的慢性內(nèi)臟痛動物模型。故本實驗擬采用建立腸易激綜合征慢性內(nèi)臟痛大鼠模型,觀察電針“百會”配“足三里”穴對心理行為和腦腸軸中5-HT水平的變化,并初步闡釋針刺緩解疼痛與改善情緒心理變化的部分內(nèi)在機制。

1 實驗材料

1.1 動物與分組 Wistar孕鼠5只,清潔級動物,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號:SCXK-(京)2007-004,待產(chǎn)下幼鼠后,按照隨機數(shù)字法分為正常組、模型組、模型束縛組、針“百會”配“足三里”穴組(以下簡稱治療組),每組7只。

1.2 主要儀器與試劑 EPM行為分析系統(tǒng),荷蘭Noldus公司;韓式電針儀LH-202H型,北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司;毫針(0.35 mm×25 mm),蘇州環(huán)球針灸醫(yī)療器械有限公司;中心靜脈導管(單腔)MEDEX普通型;乙酸,北京化學試劑公司;液體石蠟,北京化學試劑公司;Elisa試劑盒,美國R&D公司生產(chǎn),北京環(huán)宇金科生物醫(yī)學技術(shù)有限公司進口分裝,批號:20120419。

1.3 模型制備 采用母子分離和幼鼠醋酸灌腸法制備腸易激綜合征動物模型,對新出生2～8日齡的幼鼠,每日與母鼠分離2 h。9～21日齡的幼鼠每日與母鼠分離2 h的同時給予直腸內(nèi)醋酸刺激(將石蠟油潤滑后的直徑1 mm單腔中心靜脈導管經(jīng)肛門插入2 cm,注入0.5%的醋酸0.5 mL)。從第22天后的2周內(nèi),不進行任何實驗操作,飼養(yǎng)大鼠至36日齡。

2 實驗方法

2.1 取穴 穴位參照《實驗針灸學》[3]大鼠標準穴位圖譜定位:百會穴位于頂骨正中,足三里穴位于大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm,左右各1穴。

2.2 電針方法 用布袋束縛大鼠,待其安靜后,將改良后的針具刺入治療組大鼠“百會”和雙側(cè)“足三里”穴位,并在其旁開約1 mm同一穴區(qū)皮下再刺入一針,防止兩針相觸,以免短路,膠布固定后與韓式多用電針儀相連接,同一對正負極連接同名穴[4]。韓式多用電針儀選擇疏密波,頻率2～100 Hz,電針刺激20 min,以皮膚肌肉微微顫動為度。治療組從第6周開始,共治療5次,隔日1次。模型束縛組只捆綁束縛20 min,不針刺。其余組不進行任何操作。

2.3 EPM行為學評價 將大鼠置于高架十字迷宮的中央平臺處,使其頭部正對其中一個開放壁,釋放后開始記錄5min內(nèi)大鼠在開放臂和閉合臂的進入次數(shù)和停留時間。記錄下述指標:1)進入開放臂次數(shù)(open arm entry,OE),2)進入開放臂時間(open arm time,OT),3)進入封閉臂次數(shù)(close arm entry,CE),4)進入封閉臂時間(close arm time,CT)。由以上1)～4)分別計算出:1)進入開放臂和封閉臂的總次數(shù)(OE+CE),2)在開放臂和封閉臂停留的總時間(OT+CT),3)進入開放臂次數(shù)百分數(shù):(OE%):OE/(OE+CE)×100%,4)開放壁停留時間比例(OT%):即OT/(OT+CT)×100%。

2.4 指標檢測 各組大鼠斷頭處死,在預先準備的冰盤上,分離左右雙側(cè)海馬裝入EP管內(nèi),迅速置于液氮中保存待測。取大鼠距肛門1 cm處的結(jié)腸組織1 cm,用生理鹽水沖洗后,裝入EP管內(nèi),迅速置于液氮中保存待測。采用酶聯(lián)免疫法(Elisa)檢測大鼠海馬、結(jié)腸中5-HT水平。

3 實驗結(jié)果

3.1 電針對IBS模型大鼠EPM測試行為變化的影響見表1。

表1 各組大鼠EPM測試行為的變化(±s,n=7)

表1 各組大鼠EPM測試行為的變化(±s,n=7)

注:與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組 別 OE OT正常組 29.09±14.67 4.19±1.54模型組 16.60±8.29# 1.52±1.29#模型束縛組 27.67±8.79 2.23±1.85治療組 32.65±8.53## 3.99±2.92#

3.2 電針對IBS模型大鼠海馬和結(jié)腸組織中5-HT水平的影響 見表2。

表2 各組大鼠海馬和結(jié)腸組織中5-HT水平的變化(±s,n=7)

表2 各組大鼠海馬和結(jié)腸組織中5-HT水平的變化(±s,n=7)

注:與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,#P<0.05,與模型束縛組比較,△P<0.05。

組 別 海馬5-HT 結(jié)腸5-HT 5-HT比值正常組 2.719±0.387 3.469±0.398 0.817±0.165#模型組 3.284±0.580# 2.565±0.654# 1.404±0.667#模型束縛組 3.261±0.435# 2.765±0.581# 1.216±0.265#治療組 2.709±0.331#△ 3.142±0.693# 0.888±0.158#

4 討論

中醫(yī)學認為,感受外邪、飲食所傷、情志失調(diào)及素體陽虛,均可導致臟腑氣機阻滯,氣血運行不暢,脈絡(luò)痹阻或經(jīng)脈失養(yǎng)而發(fā)生疼痛。針灸通過刺激穴位來達到鎮(zhèn)靜止痛、疏通經(jīng)絡(luò)、扶正祛邪的目的?！鞍贂毖槎矫}和足太陽經(jīng)交會穴,具有鎮(zhèn)靜安神、調(diào)和氣血的功效。有研究報道,艾灸百會穴能夠明顯升高束縛應(yīng)激模型大鼠血清中TNF-α及IL-1的含量[5]?！白闳铩毖樽汴柮魑附?jīng)合穴,具有健脾和胃、鎮(zhèn)靜止痛、扶正培元的功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),電針足三里穴可提高IBS模型大鼠血漿中CGRP含量,對腸易激綜合征起到治療作用[6]。因此本實驗以鎮(zhèn)痛、調(diào)神、鎮(zhèn)靜為切入點,選取電針“百會”配“足三里”穴的協(xié)同治療方案,觀察其緩解慢性內(nèi)臟疼痛、調(diào)節(jié)情緒心理障礙的效應(yīng)。

IBS由于發(fā)病機制復雜,目前沒有公認的動物模型,常用的動物模型主要有中樞刺激型、外周致敏型、以及二者聯(lián)合作用型。中樞刺激或外周致敏單一方法復制出的模型,雖然都可近似的反應(yīng)出IBS的臨床癥狀,但是重復性較差,癥狀存在時間短暫,自然恢復快[7],不符合患者腹部疼痛的慢性持續(xù)性過程。因此結(jié)合前期實驗的探索,本研究選擇母子分離和幼鼠醋酸灌腸聯(lián)合作用的方法制備IBS動物模型[8],此模型具有慢性化傾向,大鼠在幼年階段經(jīng)受有害性刺激,引起神經(jīng)痛覺傳導通路長期致敏,成年以后,雖然有害刺激已經(jīng)消除,但是腸道卻始終處于痛覺敏感狀態(tài)[9],符合IBS發(fā)病機制。

高架十字迷宮是利用動物對新環(huán)境的好奇和對開放臂的恐懼,所表現(xiàn)出焦慮情緒的行為學測試。實驗指標以進入開放壁次數(shù)百分數(shù)和進入開放壁時間百分數(shù)來反映動物的焦慮狀態(tài)[10]。本實驗通過電針“百會”配“足三里”穴對IBS模型大鼠進行治療,觀察大鼠高架十字迷宮測試的行為變化,結(jié)果顯示:模型組和模型束縛組大鼠的OE%和OT%值降低,經(jīng)電針治療后,OE%和OT%值升高。本實驗結(jié)果說明:持續(xù)的刺激,使IBS模型大鼠產(chǎn)生焦慮情緒,電針做為一種良性應(yīng)激源的介入啟動了機體內(nèi)源性的保護機制,從而發(fā)揮了抗焦慮的作用。

5-HT是一種廣泛存在于腦腸軸中的重要神經(jīng)遞質(zhì)。已有研究表明,腦內(nèi)5-HT的改變可導致精神行為障礙,海馬部位5-HT水平的異常升高可引起焦慮情緒的產(chǎn)生[11]。由腸嗜鉻細胞等釋放的5-HT與初級傳入纖維末端的5-HT3受體結(jié)合,改變其K+、Ca2+、Na+通道,引起感覺神經(jīng)末梢去極化,而致感覺疼痛。腸道分泌的5-HT失調(diào)時,可引起內(nèi)臟的感覺異常[12]。目前,關(guān)于IBS在結(jié)腸中5-HT水平變化的研究結(jié)果并不一致。有研究報道,5-HT蛋白表達在腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸中升高;也有研究報道,IBS組患者和潰瘍性結(jié)腸炎組患者在結(jié)腸中5-HT含量減少[13-14]。本實驗結(jié)果顯示:在海馬組織中,模型組、模型束縛組大鼠5-HT水平異常升高,經(jīng)電針治療后5-HT水平下降;在結(jié)腸組織中,模型組、模型束縛組大鼠5-HT水平異常降低,經(jīng)電針治療后,5-HT水平升高。本實驗進一步分析了海馬和結(jié)腸中5-HT的變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)海馬和結(jié)腸中5-HT的比值失調(diào),模型組、模型束縛組5-HT比值明顯高于正常組,經(jīng)電針處理后,比值降低,與正常組接近。上述結(jié)果證實,腦腸軸的功能異常使得5-HT在海馬和結(jié)腸組織中分泌、代謝失衡,進而出現(xiàn)比例失調(diào),一方面引起外周效應(yīng)器官出現(xiàn)疼痛或不適的感覺,這種感覺經(jīng)迷走神經(jīng)上傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng);另一方面中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于5-HT水平異常,而出現(xiàn)焦慮不安狀態(tài)。電針介入后,通過調(diào)節(jié)腦腸軸中5-HT水平的紊亂,進而減輕疼痛癥狀,使焦慮狀態(tài)得到改善。

綜上所述,慢性內(nèi)臟痛可伴隨情緒心理行為的改變,其機制可能與腦腸軸功能紊亂,進而導致5-HT分泌、代謝失調(diào)有關(guān)。電針配穴介入后,調(diào)節(jié)了機體內(nèi)環(huán)境的紊亂狀態(tài)和腦腸軸中5-HT的平衡失調(diào),從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛、調(diào)神、抗焦慮的作用。

[1]王錦琰.內(nèi)臟痛[J].中國疼痛醫(yī)學雜志,2006,12(3):130.

[2]孫潔,溫進,魏慧芳,等.電針不同穴位對慢性炎癥痛模型大鼠心理行為改變的實驗觀察[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,11(20):3820-3824.

[3]張露芬.實驗針灸學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2010:219.

[4]任曉暄,郭孟瑋,趙雅芳,等.電針三陰交和血海穴對實驗性類痛經(jīng)大鼠痛調(diào)節(jié)機制的影響[J].中醫(yī)藥學報,2011,39(6):15-20.

[5]陳磊,魏惠芳,仲大奎,等.針灸百會穴對束縛應(yīng)激模型大鼠血清TNF-α及IL-1含量變化的影響[J].吉林中醫(yī)藥,2012,32(1):76-78.

[6]楊磊,趙雅芳,李瀅,等.電針不同穴位對腸易激綜合征模型大鼠血漿CGRP、VIP、ET含量的影響[J].吉林中醫(yī)藥,2011,31(12):1235-1237.

[7]李鐵男,馬騰飛,王業(yè)秋,等.腸易激綜合征模型復制方法概述[J].中醫(yī)藥信息,2010,27(6):94-96.

[8]Wen-lian Zhu,Ying Li,Hui-fang Wei,et al.Effent of electroacupuncture at different acupoints on neuropeptide and somatostatin in rat brainwith irritable bowel syndrome[J].Chinese Journal of Integrative Medicine,2012,18(4):288-292.

[9]Mayer EA,Gehart GF.Basic and clinical aspects of visceral hyperalgesial[J].Gastroenterology,1994,107:271-293.

[10]Pometlova M,Nohejlova-Deykun K,Slamberova R.Anxiogenic effect of low-dose Methamphetamine in the test of Elevated Plusmaze[J].Prague Medical Report,2012,113(3):223-230.

[11]周奇志,趙紀嵐,蔡定均,等.電針對慢性情緒應(yīng)激焦慮大鼠中樞單胺遞質(zhì)與γ氨基丁酸失平衡的調(diào)節(jié)作用[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(10):926-929.

[12]祝淑貞.5-HT與腸易激綜合征發(fā)病的內(nèi)在相關(guān)性[J].臨床消化雜志,2004,16(5):229-230.

[13]唐洪梅,房財富,廖小紅,等.神經(jīng)肽Y和5-羥色胺在腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠中表達的研究[J].中國藥理學通報,2012,28(7):916-920.

[14]CoatesMD,Mahoney CR,Linden DR,et al.Molecular defects inmucosal serotonin content and decreased serotonin reuptake transporter inulcerative colitisand irritable bowel syndrome[J].Gastroen terology,2004,126:1657-1664.