響應(yīng)面法優(yōu)化螺旋藻藻藍(lán)蛋白的超聲波提取工藝

邵明飛，張宏宇，楊金萍，張?jiān)试?，劉兆普，?松

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095;2.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所生物資源實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái)264003;3.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái)264003;4.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049)

藻藍(lán)蛋白作為天然捕光色素蛋白，是由脫輔基蛋 白與藻藍(lán)膽素(開(kāi)鏈線性四吡咯)共價(jià)結(jié)合而成，其基本結(jié)構(gòu)由α亞基(17000Da)和β亞基(19500Da)構(gòu)成單聚體(αβ)，然后單聚體間通過(guò)連接肽構(gòu)成三聚體(αβ)3或者六聚體(αβ)6，α 亞基84位處的半胱氨酸與β亞基84位處、155位處的半胱氨酸各通過(guò)硫醚鍵共價(jià)連接藻藍(lán)膽素［1，2］。藻藍(lán)蛋白無(wú)毒、無(wú)致癌性，具有抗氧化［3］、抗菌活性［4］、抗癌［5］、保肝護(hù)肝［6］、預(yù)防糖尿?。?］、清除自由基［8］等生理活性，其不僅作為天然色素、營(yíng)養(yǎng)蛋白用于食品、化妝品行業(yè)，而且還可用作治療氧化性疾病的藥物及生物醫(yī)藥研究的熒光標(biāo)記物［9］。藻藍(lán)蛋白是螺旋藻中的一種天然藍(lán)色色素蛋白，占細(xì)胞干重的10%～20%。中國(guó)的螺旋藻養(yǎng)殖加工技術(shù)已相當(dāng)成熟，螺旋藻干粉年產(chǎn)近萬(wàn)噸，占世界總產(chǎn)量的50%以上，這為藻藍(lán)蛋白的規(guī)?；苽涮峁┝嗽匣A(chǔ)。

諸多因素影響藻藍(lán)蛋白的提取效果，其中細(xì)胞破壁方法、液料比、浸提時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白的提取效果影響較為顯著［10］。超聲波破壁技術(shù)通過(guò)微噴射流和超微束作用機(jī)制［11］，處理物料破壁率高，目的物質(zhì)提取效果好，已成為高效提取生物活性物質(zhì)的必要環(huán)節(jié)［12，13］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)曲面模型對(duì)藻藍(lán)蛋白的超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到藻藍(lán)蛋白的最佳提取條件，并將此法與凍融法、恒溫浸提法進(jìn)行比較，得知超聲波提取法用時(shí)短、藻藍(lán)蛋白得率高，適用于藻藍(lán)蛋白的快速檢測(cè)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻粉，北海生巴達(dá)生物科技有限公司提供;所有化學(xué)試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水為去離子水。

TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用有限責(zé)任公司;DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KQ2200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;BT125D電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;BCD-209FDG冷藏冰凍箱，青島澳柯瑪股份有限公司;CT15RT高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海天美科學(xué)儀器有限公司;Design Expert software(Version 8.0.5.0)Stat-Ease Inc.，Minneapolis，America。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分析

稱取一定量的螺旋藻粉，加入磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 值7.0，含有0.004 mol/L的疊氮鈉)，混勻后超聲波處理，離心(15000 r/min，15 min)，吸取1 mL上清液，用磷酸鹽緩沖液定容至100 mL，在620 nm與652 nm處測(cè)定容量瓶中液體的吸光度，根據(jù)下式［14］計(jì)算藻藍(lán)蛋白的濃度:

PC，藻藍(lán)蛋白濃度;A620，樣品在620 nm處的吸光度;A652，樣品在652 nm處的吸光度。

根據(jù)下式計(jì)算藻藍(lán)蛋白的得率:

Y ，藻藍(lán)蛋白得率;PC，藻藍(lán)蛋白濃度;V，磷酸鹽緩沖液體積;n，稀釋倍數(shù);DB，螺旋藻粉重量。

1.2.2 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用三因素的Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)優(yōu)化提取工藝參數(shù)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，規(guī)定了三個(gè)因素的變動(dòng)范圍及中心點(diǎn)值(表1)。BBD有17個(gè)析因點(diǎn)，其中有五個(gè)重復(fù)的中心點(diǎn)(表2)。采用Design Expert軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，求解如下表達(dá)式:

Y，因變量即藻藍(lán)蛋白得率;A0、Ai、Aii、Aij，模型系數(shù);Xi，Xj，因素水平。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.3 不同提取方法的比較

對(duì)3種不同藻藍(lán)蛋白提取方法進(jìn)行比較:凍融法［15］、恒溫浸提法［16］、本試驗(yàn)獲得的超聲波提取法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響

超聲波功率600W，超聲時(shí)間14 min，研究不同液料比對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響。如圖1所示，當(dāng)液料比從10 mL/g增大到30 mL/g，藻藍(lán)蛋白得率先升高后下降。當(dāng)液料比為20 mL/g時(shí)，藻藍(lán)蛋白得率最高，為10.72%。曲文娟等也得到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，液料比為20 mL/g時(shí)提取效果最好［17］。朱劼等研究結(jié)果表明，粉量為溶劑量的5%是最佳的提取參數(shù)［18］。本文試驗(yàn)結(jié)果與Sivleira等的報(bào)道不一致，他們的研究結(jié)果表明:液料比為12.5 mL/g時(shí)，藻藍(lán)蛋白提取濃度最大［19］。這可能是由于所用螺旋藻原粉性質(zhì)不同所致。Sivleira等用的螺旋藻粉是將螺旋藻泥放于40℃的烘箱中烘48 h得到的，本試驗(yàn)所采用的螺旋藻粉是螺旋藻泥噴霧干燥所得。

圖1 液料比對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響Fig 1 Effect of different ratios of PBS to raw material on extraction yield

2.1.2 超聲波功率對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響

液料比20 mL/g，超聲時(shí)間14 min，研究不同超聲波功率對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響。當(dāng)超聲波功率從400W增大到640W時(shí)，藻藍(lán)蛋白得率由9.93%升高為10.79%(圖2)。超聲波功率增大導(dǎo)致細(xì)胞膜表面及周圍的空化泡破裂［20］，產(chǎn)生大量的微裂縫及孔洞，促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)移，藻藍(lán)蛋白溶出量增加。當(dāng)超聲波功率從640W繼續(xù)增大到800W時(shí)，藻藍(lán)蛋白得率逐漸降低。這可能是由于功率的進(jìn)一步增大，產(chǎn)生的熱量無(wú)法及時(shí)地散去，溶液溫度過(guò)高引發(fā)藻藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)受到破壞而降解，導(dǎo)致得率下降。朱劼等試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波功率為630W時(shí)，藻藍(lán)蛋白提取效果最好［18］。然而，曲文娟等研究結(jié)果為:1400W是最優(yōu)的超聲波功率［17］。

圖2 超聲波功率對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響Fig 2 Effect of different ultrasonic power on extraction yield

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響

液料比20 mL/g，超聲波功率600W，研究不同超聲時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響。當(dāng)超聲時(shí)間從10 min延長(zhǎng)到14 min時(shí)，藻藍(lán)蛋白得率顯著提高(圖3)。延長(zhǎng)超聲時(shí)間可引發(fā)更多的空化泡破裂，更多的溶劑進(jìn)入細(xì)胞，促使物質(zhì)轉(zhuǎn)移［21］。當(dāng)超聲時(shí)間從14 min繼續(xù)延長(zhǎng)，藻藍(lán)蛋白得率下降，可能是產(chǎn)生的熱量不能及時(shí)散去導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白分解。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響Fig 3 Effect of different extraction time on extraction yield

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

采用Design Expert軟件對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到藻藍(lán)蛋白得率對(duì)三個(gè)因素的多元二次回歸模型:

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken design

從表3二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果可知，回歸模型高度顯著(P值＜0.0001)、失擬項(xiàng)不顯著(P值 =0.0834＞0.05)、R2=99.95%、R2adj=99.89%、C.V.=0.18，這些數(shù)據(jù)表明回歸方程擬合度和可信度均很高，能很好地對(duì)最優(yōu)工藝條件進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis results of regression and variance

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Significance of regression coefficients

由回歸方程系數(shù)顯著性檢測(cè)結(jié)果(表4)可知，試驗(yàn)中一次項(xiàng)X1極顯著、X2不顯著、X3顯著;二次項(xiàng)極顯著、不顯著不顯著;交互項(xiàng)均為極顯著。

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果作響應(yīng)曲面圖，考察擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析液料比、超聲波功率、超聲時(shí)間三者之間交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響，其響應(yīng)曲面如圖4、5、6所示。

利用Design Expert軟件對(duì)模型方程求解，得到響應(yīng)值藻藍(lán)蛋白得率最大值為10.77%時(shí)，液料比、超聲波功率、超聲時(shí)間相應(yīng)值為21.05 mL/g、640.35W、13.93 min。按照模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件，根據(jù)實(shí)際情況，在液料比為21 mL/g、超聲功率為640W、超聲時(shí)間為14 min的工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到的藻藍(lán)蛋白得率(10.76±0.087)%(n=3)和預(yù)測(cè)值吻合較好，表明該模型工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。

2.3 不同提取方法比較

從圖7可知，超聲波提取法藻藍(lán)蛋白得率為10.76%，凍融法藻藍(lán)蛋白得率為7.89%，恒溫浸提法藻藍(lán)蛋白得率為6.57%。不同方法對(duì)螺旋藻細(xì)胞壁的破壞程度不同，導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白溶出量各異。超聲波提取法半天即可完成測(cè)定工作，而另外兩種方法所需時(shí)間較長(zhǎng)。

圖7 不同提取方法對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響Fig 7 Effect of different extraction methods on extraction yield

3 結(jié)論

1)由單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析結(jié)果得到的超聲波提取螺旋藻中藻藍(lán)蛋白的最佳工藝條件為:液料比為21 mL/g、超聲波功率為640W、超聲時(shí)間為14 min，此時(shí)藻藍(lán)蛋白得率為10.76%。

2)對(duì)不同提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，超聲波提取法操作時(shí)間短、藻藍(lán)蛋白得率高。本方法適用于藻藍(lán)蛋白的快速檢測(cè)分析。

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