某豬場仔豬大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

魯志平，龐 璞，楊曉玲，孫 霖，李云祝，吳顯祥

（四川省大竹縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 大竹 635100）

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌（Escherichia coli，簡寫E.coli）某些血清型引起的一種豬腸道傳染性疾病，臨床上分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病。隨著規(guī)模化、集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，仔豬細(xì)菌性腹瀉的發(fā)病率越來越高，危害也越來越嚴(yán)重。為了掌握四川大竹縣仔豬大腸桿菌病的流行情況，筆者在轄區(qū)內(nèi)某一養(yǎng)豬合作社的豬場采集了疑似仔豬黃、白痢的病料，并進(jìn)行了病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)等相關(guān)研究，為該豬場制定防控措施提供有益參考?，F(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料 選取大竹縣某養(yǎng)豬合作社規(guī)模豬場疑似黃、白痢感染的腹瀉仔豬，采用滅菌棉拭子從發(fā)病、瀕死或死亡仔豬的直腸取樣，共采集疑似病料20份，由大竹縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心診斷室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯按文獻(xiàn)制備；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管、枸櫞酸鹽、MR試劑、VP試劑、靛基質(zhì)等試劑，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 血清 E.coli O抗原單價(jià)血清，購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.1.4 藥敏片 成套藥敏紙片，含30種抗生素，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 將采集的病料分別劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24h；然后挑取典型的單個(gè)菌落分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行純菌增殖，觀察菌落形態(tài)，再涂片，作革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.2 生化試驗(yàn) 將純化菌株按腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定要求分別接種于微量生化管內(nèi)，37℃培養(yǎng)48～72h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 分離菌的血清型鑒定 將經(jīng)形態(tài)特征及生化特性鑒定為E.coli的菌株接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h；挑取純培養(yǎng)物中的光滑菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24h；用2mL 0.5%的石炭酸生理鹽水洗下瓊脂斜面培養(yǎng)物，置小圓底試管中，制成菌懸液；121℃下高壓滅菌2 h，破壞其莢膜抗原，制成高壓抗原。用E.coli O抗原單價(jià)血清進(jìn)行微量凝集試驗(yàn)，作血清型鑒定。同時(shí)以高壓抗原和0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 將分離鑒定后的E.coli純培養(yǎng)物均勻地涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，無菌條件下用滅菌鑷子將藥敏紙片平貼于培養(yǎng)基表面，要求紙片間距離≥24mm、紙片與培養(yǎng)皿邊緣距離≥15mm，且每種藥物需在不同位置貼2片，37℃倒置培養(yǎng)，分別于16h和24h觀察并記錄結(jié)果，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，并計(jì)算其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離及形態(tài)觀察 經(jīng)過37℃培養(yǎng)24 h后，分離菌純培養(yǎng)物在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明的小凸起菌落；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長為圓形、中等大小紅色菌落，直徑為1～2mm；在SS瓊脂培養(yǎng)基上生長為中等大小、均勻紅色、半透明、圓形、稍凸起的光滑菌落；在肉湯培養(yǎng)基中呈渾濁狀態(tài)，管底有灰白色沉淀，液面管壁有菌環(huán)，伴有糞臭味。

分離菌經(jīng)涂片，革蘭氏染色、鏡檢，可觀察到中等大小、無芽胞、單個(gè)或多個(gè)排列、形態(tài)較為一致、兩端鈍圓的革蘭氏陰性球桿菌，疑似E.coli。

2.2 生化鑒定 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，該菌的16項(xiàng)生化鑒定結(jié)果均與E.coli相符，同時(shí)結(jié)合病癥、菌落培養(yǎng)特性及菌體特性，確定該分離菌為E.coli。詳見表1。

2.3 血清型鑒定 結(jié)果見表2。備檢的E.coli通過定型，分屬于 4 種血清型，優(yōu)勢血清型為 O20、O101、O141，基本代表了目前該養(yǎng)豬合作社豬場仔豬黃、白痢E.coli的主要流行血清型。

2.4 藥物敏感性試驗(yàn) 分離E.coli菌株對復(fù)達(dá)欣（頭孢他啶）、多粘霉素B高度敏感，對氨芐西林、哌拉西林、頭孢呋辛、阿米卡星、新霉素等藥物中度敏感，對其余17種藥物表現(xiàn)為耐藥或高度耐藥。詳見表3。

3 小結(jié)與討論

3.1 隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，由致病性E.coli引起的仔豬腹瀉嚴(yán)重威脅著仔豬的健康，死亡率相對較高，耐過仔豬大多成為“僵豬”，飼料報(bào)酬低；并且該病易與其他豬病混合感染，造成仔豬死亡率更高。因此，開展針對性的監(jiān)測是目前集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中有效防控該病的重要手段。

表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果

表2 E.coli O抗原血清型鑒定結(jié)果

表3 E.coli對30種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)

3.2 通過對采集的疑似仔豬黃、白痢拭子病料進(jìn)行病原分離、形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察及生化鑒定，證實(shí)該分離菌為典型的E.coli。說明該場仔豬在出生后所發(fā)生的腹瀉主要是由致病性E.coli引起的。

3.3 從本次備檢樣品中分離出的致病性E.coli，有4種血清型，其中血清型O20、O101、O141所占比例較大，表明O20、O101、O141為優(yōu)勢血清型，代表了目前該養(yǎng)豬合作社豬場中仔豬黃、白痢E.coli的主要流行血清型。從全國各地區(qū)報(bào)道的血清型來看，各省市流行的豬源致病性E.coli O型血清型有較大差別，存在地區(qū)性、多樣性，甚至同一地區(qū)的不同豬場，所流行的主要血清型也可能有所不同。此前，四川省其他市、區(qū)、縣的規(guī)?；i場中有關(guān)致病性E.coli O抗原血清型的鑒定及分布還鮮見報(bào)道。因此，定期對豬場的E.coli進(jìn)行分離鑒定，明確當(dāng)前流行的血清型，有利于開展針對性的免疫預(yù)防和臨床診治。

3.4 由于在養(yǎng)豬生產(chǎn)中濫用抗生素，造成目前E.coli的耐藥譜和耐藥水平不斷提高，而且抗生素在畜體內(nèi)殘留對人類的健康也會(huì)產(chǎn)生不良影響。通過對分離E.coli進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，表明該場的E.coli耐藥情況已較為嚴(yán)重，而且呈多重耐藥。30種抗生素類藥物中，只對復(fù)達(dá)欣、多粘霉素B高度敏感，而對氨芐西林、哌拉西林、頭孢呋辛、阿米卡星、新霉素等藥物中度敏感，對其余17種藥物表現(xiàn)為耐藥或高度耐藥。所以在治療過程中，應(yīng)通過采用有效的藥物和適當(dāng)劑量來制定合理的治療方案，做到“有的放矢”。

3.5 通過本試驗(yàn)研究，掌握了大竹縣該養(yǎng)豬合作社仔豬腹瀉的發(fā)病情況，并篩選出了有效的治療藥物，為制定科學(xué)的飼養(yǎng)管理模式，強(qiáng)化公共環(huán)境衛(wèi)生安全等起到了積極的推動(dòng)作用，也達(dá)到了提高豬場產(chǎn)仔成活率和仔豬育成率的目的。

參與文獻(xiàn)：

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[2] 趙曉靜，高 婕，宋勤葉，等．保定地區(qū)仔豬大腸桿菌病的調(diào)查與對策分析[J]．中國動(dòng)物檢疫，2012，29（3）：45-46．

[3] 高月林，解志峰，等．黑龍江省東部地區(qū)腹瀉仔豬大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]．養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2011，（11）：113．

[4] 陳天壽，等．微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：257-260．

[5] 傅彩霞，鄭瑞峰，郭 峰，等．北京部分地區(qū)仔豬大腸桿菌病血清型調(diào)查[J]．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，（3）：79-80．