基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和析因設(shè)計(jì)的土壤中EE2和BPA超聲輔助生物降解模型

李 魚,張 琛,周長志,孟 沖

(華北電力大學(xué) 資源與環(huán)境研究院,北京 102206)

雌激素(endocrine disrupting chemicals,EDCs)是一類通過影響內(nèi)分泌系統(tǒng)功能,破壞生物體維持機(jī)體穩(wěn)定性和調(diào)控作用的物質(zhì)[1].乙炔基雌二醇(EE2)和雙酚A(BPA)均為人工合成雌激素,在工業(yè)生產(chǎn)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中應(yīng)用廣泛.EE2是養(yǎng)殖業(yè)飼料、口服避孕藥和激素補(bǔ)充用藥的主要成分,在ng/L量級即具有較強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾性[2-3].EE2進(jìn)入自然水體后,可誘導(dǎo)雄性魚類體內(nèi)蛋白的合成,從而影響魚類的繁殖能力[4].BPA作為化工原料廣泛用于食品包裝和塑料器具,在微量水平下即可表現(xiàn)雌激素效應(yīng),影響人類和動物的生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)[5].雌激素化合物進(jìn)入環(huán)境后,在自然水體、沉積物、地下水以及土壤中均有不同程度的殘留[6-8].

生物降解可在保證不引入二次污染物的前提下有效去除環(huán)境中有機(jī)污染物.本文選取惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)對人工合成雌激素EE2和BPA進(jìn)行超聲輔助生物降解.將碳源添加量、氮源添加量、接種量、超聲時(shí)間和降解時(shí)間作為輸入,EE2和BPA的降解率作為輸出,分別構(gòu)建超聲輔助生物降解EE2和BPA的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型[9-12].利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測不同25-1析因設(shè)計(jì)[13]條件下對應(yīng)的生物降解率(響應(yīng)值),并分析了影響因子的主效應(yīng)和交互作用,進(jìn)而求解土壤-水體系中EE2和BPA的最優(yōu)生物降解條件.針對EE2和BPA的生物降解差異性,結(jié)合污染物自身的移動性和持久性探討其降解機(jī)理.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

17α-乙炔基雌二醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>97%,德國Sigma公司)；雙酚A(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%,美國Aldrich公司)；甲醇(色譜純,美國Burdick &Jackson公司)；氯化鈣和氫氧化鈉(優(yōu)級純,北京化工廠)；用甲醇配制雌激素的混合儲備液(20 mg/L)于4 ℃冰箱中保存,標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液由混合儲備液稀釋配制而成.

高效液相色譜儀(Agilent 1200型,美國Agilent公司)；分析天平(FA1004型,上海海鷗儀器有限公司)；回旋式振蕩器(HY-5型,江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠);數(shù)控超聲波清潔器(KQ3200DE(0～150 W)型,昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司).

1.2 惡臭假單胞菌培養(yǎng)基的制備材料

富集培養(yǎng)基的制備：酵母浸粉5.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化鈉10.0 g,蒸餾水1.0 L,調(diào)節(jié)pH≈7.0.無機(jī)鹽培養(yǎng)基的制備：磷酸氫二鉀4.35 g,磷酸二氫鉀1.70 g,硫酸鎂0.20 g,氯化銨2.10 g,硫酸錳0.05 g,七水合硫酸亞鐵0.01 g,結(jié)晶水氯化鈣0.03 g,蒸餾水1.0 L,pH=6.8～7.0.

1.3 惡臭假單胞菌的富集培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保存完好的斜面培養(yǎng)基在37 ℃恒溫條件下活化24 h后,在超凈工作臺中采用接種環(huán)挑取菌落,接種于500 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中,瓶口用8層紗布和報(bào)紙包扎,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.重復(fù)富集細(xì)菌兩次,第二次接種液取自第一次培養(yǎng)液.

1.4 雌激素生物降解

在盛有50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中加入定量的雌激素溶液后,接入不同體積的菌液,于37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d,每24 h取樣一次,考察惡臭假單胞菌對雌激素的生物降解規(guī)律.同時(shí)在50 mL具有一定濃度雌激素的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接入8.0 mL菌液(OD600≈0.8,處于對數(shù)生長期),在功率為30 W,分別超聲1,5,10,15 min,每隔24 h取樣一次,取樣后即對溶液進(jìn)行超聲作用,并置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d,設(shè)兩個(gè)平行樣.實(shí)驗(yàn)將未接入惡臭假單胞菌菌液的雌激素溶液設(shè)置為空白對照.考察超聲波作用對惡臭假單胞菌生物降解雌激素的影響.根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法,分別考察以碳源添加量、氮源添加量、惡臭假單胞菌接種量、超聲輔助時(shí)間和降解時(shí)間為降解影響因子的單因素實(shí)驗(yàn),共60組.隨機(jī)選取30組數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模的訓(xùn)練集,20組數(shù)據(jù)作為建模的驗(yàn)證集和測試集,10組作為預(yù)測集以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ途?

1.5 雌激素的檢測條件

采用高效液相色譜對雌激素進(jìn)行分離.流動相為甲醇和純凈水.EE2和BPA檢測的洗脫程序?yàn)椋?～4 min內(nèi)V(甲醇)∶V(水)由0.8降至0.7,4～10 minV(甲醇)∶V(水)=0.7,后運(yùn)行時(shí)間設(shè)定為8 min；流速：1.0 mL/min.采用Agilent ZORBAX SB-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫為30 ℃；可變波長紫外檢測器的檢測波長λ=280 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 EE2和BPA降解的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

2.1.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)構(gòu) 將影響EE2和BPA生物降解的因素：碳源添加量(X1)、氮源添加量(X2)、底物濃度(X3)、超聲時(shí)間(X4)和降解時(shí)間(X5)作為5個(gè)輸入變量,EE2和BPA的生物降解率(Y)作為1個(gè)輸出變量,表達(dá)式為

Y=f(X1,X2,X3,X4,X5),

隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)設(shè)為9,構(gòu)建三層前向反饋5×9×1結(jié)構(gòu)模型.訓(xùn)練目標(biāo)設(shè)為5.0×10-5,學(xué)習(xí)效率為0.01.將30組數(shù)據(jù)用于模型的訓(xùn)練集,20組數(shù)據(jù)用于驗(yàn)證集和測試集,以驗(yàn)證模型的泛化能力.通過對模型的反復(fù)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練,確定能正確反映雌激素EE2和BPA在土壤-水系統(tǒng)中降解的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型.

2.1.2 EE2和BPA降解的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型精度分析 為驗(yàn)證建立模型的準(zhǔn)確性和有效性,本文隨機(jī)選取10組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為預(yù)測集樣本用于檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測能力.采用相關(guān)系數(shù)(R2)和模擬效率系數(shù)(NSC)考察建立模型的預(yù)測能力和精度,結(jié)果如圖1所示.

圖1 EE2(A)和BPA(B)生物降解率檢驗(yàn)樣本的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between experimental and predictive degradation rates of EE2 (A) and BPA (B)

若BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型輸出的預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值的R2>0.90,則模型的預(yù)測能力較高;若R2<0.90,則模型的預(yù)測能力具有局限性[14].由圖1可見,散點(diǎn)均勻分布于直線兩側(cè),表明模型的預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值具有較高的契合度.EE2和BPA在土壤-水體系中降解率的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值的R2分別為0.952 5和0.983 1.

本文考察了EE2和BPA在土壤-水體系中生物降解的模擬效率系數(shù)(NSC)取值,表達(dá)式為

(1)

NSC值越接近1,預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值的匹配程度越高.結(jié)果表明,土壤-水體系中EE2和BPA生物降解模型的NSC分別為0.956 5和0.957 2,即模型具有較高的精度.EE2和BPA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的驗(yàn)證集、測試集和預(yù)測集均方差分別為0.007 0,0.445 6,0.101 4和0.006 9,0.500 6,0.718 5,表明模型預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值的吻合度較高.

2.2 EE2和BPA降解的析因設(shè)計(jì)

本文將影響生物降解的條件(X1,X2,X3,X4,X5)設(shè)置為自變量,EE2和BPA的生物降解率(Y1和Y2)設(shè)置為響應(yīng)值,采用25-1分式析因設(shè)計(jì)雌激素降解實(shí)驗(yàn),析因設(shè)計(jì)因素水平列于表1.

表1 25-1析因設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of 25-1 factorial design

利用已建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測25-1分式析因設(shè)計(jì)的響應(yīng)值,降解實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表2.基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對降解率的預(yù)測結(jié)果,對影響生物降解的各因素進(jìn)行分析.當(dāng)顯著性水平p<0.05時(shí),選取主要影響因子作為回歸方程的自變量,EE2的降解率作為回歸方程的因變量,其多元回歸方程表達(dá)式為

其中:一元自變量系數(shù)的正負(fù)表示與降解率成正比或反比;二元自變量系數(shù)的正負(fù)表示二階交互作用對生物降解效果的協(xié)同作用或拮抗作用.

表2 25-1析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)Table 2 Experimental arrangement of 25-1 factorial design

EE2影響因子的Pareto分布如圖2所示.由圖2可見,主因子X3,X4和X5以及交互作用X1×X2和X1×X3的Pareto百分比平方和均大于10,即上述因子對EE2降解率的影響較大.由式(2)可見:主因子X3和X5與Y1成正比,X4與Y1成反比；交互作用X1×X2和X1×X3在EE2降解過程中具有協(xié)同作用.

當(dāng)顯著性水平p<0.05時(shí),建立以BPA降解率為因變量的多元回歸方程,其表達(dá)式為

BPA影響因子的Pareto分布如圖3所示.由圖3可見，主因子X2,X4以及交互作用X1×X2,X1×X3和X2×X3的百分比平方和均大于10,即上述因子對BPA降解率的影響較大.由式(3)可見:主因子X2與Y2成正比,X4與Y2成反比；在降解過程中,二元交互作用X1×X2,X1×X3具有協(xié)同作用,X2×X3具有拮抗作用；X4在EE2和BPA的降解過程中均為負(fù)效應(yīng).

圖2 EE2影響因子的Pareto分布Fig.2 Pareto distribution of EE2 factors

圖3 BPA影響因子的Pareto分布Fig.3 Pareto distribution of BPA factors

2.3 雌激素生物降解條件優(yōu)化

本文考察了各影響因子對EE2和BPA降解效果影響的趨勢,結(jié)果如圖4所示.

圖4 EE2和BPA的因素影響趨勢Fig.4 Influence tendency of factors for EE2 and BPA

由圖4可見:影響因子X1～X5對Y1和Y2的影響趨勢基本一致.隨著X1,X2,X3和X5水平取值的增大,Y1和Y2呈增大趨勢并在高水平處達(dá)到最大值;隨著因子X4水平取值的增大,Y1和Y2呈下降趨勢.因此在降解過程中為微生物提供充足的碳源和氮源,可使惡臭假單胞菌處于生長對數(shù)期,選擇適宜的超聲時(shí)間可促進(jìn)惡臭假單胞菌的生物活性,提高細(xì)菌的代謝作用,從而增強(qiáng)EE2和BPA的降解效果.

通過對EE2和BPA影響因子趨勢的對比分析可獲得土壤-水體系中EE2和BPA的最優(yōu)降解條件為：10%的碳源添加量；10%的氮源添加量；接種量為20 mL；超聲時(shí)間為1 min；降解時(shí)間為168 h.各因子對EE2和BPA在土壤-水體系中降解的影響趨勢與文獻(xiàn)[15]結(jié)果一致.在最優(yōu)降解條件下,利用已建立的多元回歸模型預(yù)測EE2和BPA的最大降解率分別為87.13%和69.27%.

2.4 雌激素降解機(jī)理分析

在相同生物降解條件下,EE2和BPA在土壤-水體系中的降解效果差異較大.EE2和BPA的有機(jī)碳標(biāo)化系數(shù)(lgKoc)和半衰期列于表3.

表3 EE2和BPA的化學(xué)參數(shù)Table 3 Chemical parameters of EE2 and BPA

lgKoc-降解率和半衰期-降解率的線性方程表達(dá)式分別為:

DR=255.14 lgKoc-1 099.27,

(4)

DR=-0.72HL+90.87,

(5)

其中:DR為EE2和BPA的降解率;lgKoc和HL分別表示EE2和BPA有機(jī)碳標(biāo)化系數(shù)和半衰期.由表3可見,EE2的lgKoc大于BPA的lgKoc，EE2的半衰期小于BPA的半衰期.由式(4)和式(5)可見,EE2和BPA的lgKoc與其降解率成正比,半衰期與降解率成反比.因此,EE2和BPA的降解效果存在差異是由于雌激素在土壤-水體系中的移動性強(qiáng)弱不同及雌激素在環(huán)境中的持久性不同所致.

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