西維來司鈉對腦出血模型大鼠腦組織損傷的保護(hù)作用研究

黃艷，王波，董志，楊洪波，何科容（.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院，重慶408400；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 40006）

腦出血（Cerebral hemorrhage）是嚴(yán)重危害老年人的一種常見病、多發(fā)病，且發(fā)病率、死亡率和致殘率均較高，是急性腦血管病中的危重類型[1]。腦出血時(shí)，除了血腫的占位性病變外，患者還會(huì)出現(xiàn)一系列繼發(fā)性腦損傷，如腦水腫、缺血、炎癥反應(yīng)、血腫周圍組織能量代謝紊亂及氧自由基損傷等[2-3]。由于腦出血病理生理機(jī)制復(fù)雜，其病因?qū)W尚未完全清楚，多數(shù)患者仍然以內(nèi)科保守治療為主，至今還沒有特效的治療方法[4]。西維來司鈉（Sivelestat sodium）是一種小分子中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（Neutropil elastase，NE）抑制劑，能選擇性抑制NE，可用于急性肺損傷的治療。近年國外有研究報(bào)道西維來司鈉能夠改善腦缺血/再灌注引起的腦水腫、腦損傷及炎癥反應(yīng)[5]，能減輕呼吸系統(tǒng)疾病的炎癥反應(yīng)[6]。但西維來司鈉對腦出血引起的腦組織損傷是否也有保護(hù)作用，目前國內(nèi)外少見相關(guān)報(bào)道。本研究選用目前最常用且建模成功率較高的膠原酶誘導(dǎo)建立腦出血模型，探討西維來司鈉對腦出血模型大鼠腦組織的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

大鼠腦主體定位儀（國營西北光學(xué)儀器廠）；電子分析天平（德國Sartorius公司）；低溫離心機(jī)（美國Sigma公司）；紫外分光光度計(jì)（上海光電醫(yī)用儀器有限公司）；BI2000免疫組化分析系統(tǒng)（成都泰盟科技公司）。

1.2 藥品與試劑

Ⅶ型膠原酶（美國Sigma公司，批號：C0130，含量：0.25～1.0 U/mg）；水合氯醛（蘇州正興化工廠，批號：070120，分析純）；西維來司鈉（重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院，批號：070310，純度：99.5%）；一氧化氮（NO）試劑盒、髓過氧化物酶（MPO）試劑盒和免疫組化試劑盒（南京建成科技有限公司）；核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）；NE酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物

健康Wistar大鼠40只，清潔級，♂，體質(zhì)量200～250 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號：SCXK（渝）2007-0001。

2 方法

2.1 分組與建模

40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和西維來司鈉高、中、低劑量組，每組8只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠參考Rosenberg GA等[7]的方法建立腦出血模型，建模手術(shù)后各組大鼠分籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組和模型組大鼠于建模前30 min分別經(jīng)尾靜脈緩慢給予0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水），西維來司鈉高、中、低劑量組大鼠分別同法給予200、80、30 mg/kg的西維來司鈉溶液[8]。

2.2 標(biāo)本的收集與處理

各組大鼠術(shù)后24 h經(jīng)水合氯醛麻醉后快速斷頭取腦，分離血腫周圍腦組織和血腫腦組織，精確稱質(zhì)量，置于－70℃保存?zhèn)溆?。測定時(shí)，將血腫周圍腦組織用生理鹽水在冰浴環(huán)境內(nèi)以玻璃勻漿器制成10%的腦組織勻漿。

2.3 血腫周圍腦組織中NE、NO及MPO含量的測定

取各組大鼠10%的血腫周圍腦組織勻漿，4℃下12000×g離心5 min，取上清液待測。采用雙抗體夾心ELISA法，按相應(yīng)試劑盒說明書操作測定血腫周圍腦組織中NE、NO及MPO含量。

2.4 血腫腦組織中NF-κB表達(dá)的檢測

采用免疫組化法，將各組大鼠的血腫腦組織切片放入4%的多聚甲醛中，固定24 h后經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，連續(xù)冠狀切片；將組織切片粘貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，免疫組化染色，按照試劑盒說明書操作。顯微鏡下觀察并照相，以組織中有明顯二氨基聯(lián)苯氨（DAB）棕褐色染色者判斷為陽性。采用BI2000免疫組化分析系統(tǒng)進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算4個(gè)視野的陽性細(xì)胞平均數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 血腫周圍腦組織中NE、NO及MPO的含量變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血腫周圍腦組織中NE、NO及MPO含量均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，西維來司鈉高、中劑量組大鼠血腫周圍腦組織中NE、NO及MPO含量均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），西維來司鈉低劑量組大鼠上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠血腫周圍腦組織中NE、NO、MPO的含量變化見表1。

3.2 血腫腦組織中NF-κB的表達(dá)變化

假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)幾乎無NF-κB表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血腫腦組織中NF-κB表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；與模型組比較，西維來司鈉高、中劑量組大鼠血腫腦組織中NF-κB表達(dá)均明顯減弱（P＜0.01或P＜0.05），西維來司鈉低劑量組大鼠該指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠血腫腦組織中NF-κB表達(dá)的顯微鏡圖見圖1，結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血腫周圍腦組織中NE、NO、MPO的含量和血腫腦組織中NF-κB表達(dá)變化（±s，n＝6）Tab 1 The contents of NE，NO and MPO in cerebral tissue around the hematoma and the expression of NF-κB in cerebral tissue of rats in each grou（p±s，n＝6）

表1 各組大鼠血腫周圍腦組織中NE、NO、MPO的含量和血腫腦組織中NF-κB表達(dá)變化（±s，n＝6）Tab 1 The contents of NE，NO and MPO in cerebral tissue around the hematoma and the expression of NF-κB in cerebral tissue of rats in each grou（p±s，n＝6）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.sham operation gruop：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

NF-κB，個(gè)/4個(gè)視野1.50±1.2925.00±6.48＊8.25±3.40##14.25±6.80#20.25±6.70組別假手術(shù)組模型組西維來司鈉高劑量組西維來司鈉中劑量組西維來司鈉低劑量組NE，ng/ml 0.356±0.0432.398±0.324＊1.353±0.294#1.696±0.325#2.128±0.190 NO，μmol/g prot 1.56±0.263.13±0.17＊2.04±0.21##2.43±0.31##3.00±0.25 MPO，U/g 0.063±0.0160.291±0.022＊0.196±0.023##0.243±0.019##0.278±0.023

圖1 各組大鼠血腫腦組織中NF-κB表達(dá)的顯微鏡圖（×400）A.假手術(shù)組；B.模型組；C.西維來司鈉高劑量組；D.西維來司鈉中劑量組；E.西維來司鈉低劑量組Fig 1 The expression of NF-κB in cerebral tissue of rats in each group by microscope（×400）A.sham operation group；B.model group；C.sivelestat sodium highdose group；D.sivelestat sodium medium-dose group；E.sivelestat sodium low-dose group

4 討論

NE是一種內(nèi)源性蛋白酶，生理情況下位于中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中，主要參與對革蘭陰性桿菌的殺滅作用；同時(shí)它也參與中性粒細(xì)胞遷移，促進(jìn)炎癥因子如白細(xì)胞介素2（IL-2）、IL-6、IL-8等的表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，因此它對于機(jī)體防御功能非常重要。但在炎癥情況下，激活的中性粒細(xì)胞釋放大量的NE至細(xì)胞外，引起彈性蛋白、蛋白多糖和膠原等的降解，從而導(dǎo)致組織、細(xì)胞和血管基底膜損傷。國外研究報(bào)道NE與大鼠腦缺血/再灌注引起的腦損傷有關(guān)，用西維來司鈉治療可以明顯改善腦組織損傷，其作用機(jī)制可能與其減少NE的生成有關(guān)[5]。在正常情況下，NO作為一種血管舒張因子參與腦血管舒縮的調(diào)節(jié)，而高濃度的NO卻是神經(jīng)細(xì)胞損傷的毒性分子[9]。本研究顯示模型組大鼠表現(xiàn)出典型的腦出血病理學(xué)改變，證明建模是成功的，模型組大鼠血腫周圍腦組織中NE、NO含量較假手術(shù)組明顯增加。NE抑制劑西維來司鈉處理不僅能降低模型大鼠血腫周圍腦組織中炎癥細(xì)胞浸潤，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，還能減少NE、NO含量，并與劑量呈正相關(guān)。這表明西維來司鈉對腦出血模型大鼠的腦組織具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制NE、NO的生成有關(guān)。

NF-κB是一種重要的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它廣泛參與炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡及人類的多種疾病。本研究發(fā)現(xiàn)腦出血后血腫周圍組織NF-κB表達(dá)增加、MPO含量明顯增加，這兩者之間存在緊密聯(lián)系。結(jié)合前人的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果我們可以推測ICH大鼠腦內(nèi)MPO含量的增加是由于NF-κB表達(dá)增強(qiáng)，引起細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）表達(dá)增加[10]，從而導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞浸潤。本研究顯示西維來司鈉能呈劑量正相關(guān)地降低大鼠血腫腦組織中NF-κB表達(dá)、降低MPO含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

綜上所述，西維來司鈉對腦出血模型大鼠的腦組織有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與NE、NO、MPO含量減少及NF-κB表達(dá)減弱有關(guān)。

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