比阿培南開環(huán)物雜質(zhì)的確證及含量測定Δ

陳松杰，王德剛，張 莉，鐘雅妮（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，廣東中山 528467）

比阿培南（Biapenem）是一種新型1β-甲基碳青霉烯類抗生素，具有抗菌譜廣、對腎脫氫肽酶穩(wěn)定、藥動(dòng)學(xué)參數(shù)優(yōu)良、臨床治療效果好、耐受性好和不良反應(yīng)少等特點(diǎn)[1]。目前各國藥典均未收載比阿培南。經(jīng)分析其主要降解產(chǎn)物為聚合物和開環(huán)物，文獻(xiàn)[2-6]中多對其聚合物進(jìn)行研究，對其開環(huán)物的研究鮮有報(bào)道。而從比阿培南聚合物的產(chǎn)生途徑可知，其開環(huán)物可與比阿培南反應(yīng)生成二聚物，故對開環(huán)物進(jìn)行控制可在一定程度上降低聚合物產(chǎn)生的可能性。

筆者另查閱注射用Omegacin的說明書[7]知，原研品中可能存在的雜質(zhì)包括2個(gè)開環(huán)物，現(xiàn)暫命名為比阿培南開環(huán)物A和開環(huán)物B，且開環(huán)物A為比阿培南體內(nèi)代謝產(chǎn)物。本文通過試驗(yàn)建立了測定比阿培南開環(huán)物雜質(zhì)的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，并采用色譜-質(zhì)譜（LC-MS）方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，同時(shí)考察了自制樣品及原研品中開環(huán)物雜質(zhì)的含量水平。

1 材料

LC-20AT型HPLC儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；AE240型電子天平（瑞士Mettler toledo公司）；6120型單四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）。

比阿培南原料藥（自制，批號：4031204001、4031204002、4031204003，純度：99.96%、99.96%、99.95%）；注射用比阿培南（原研品，日本明治制果制藥株式會(huì)社，批號：4004，測定時(shí)已近效期，規(guī)格：每支0.3 g）；比阿培南開環(huán)物B雜質(zhì)對照品（自制，經(jīng)質(zhì)譜、元素分析及核磁共振氫譜確證其結(jié)構(gòu)，批號：120703，純度：99.8%）；由于比阿培南開環(huán)物A雜質(zhì)對照品獲得較為困難，因此擬取其HPLC洗脫成分采用LC-MS方法確證其結(jié)構(gòu)；乙腈為色譜純，水為自制超純水，其他各試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

HPLC色譜條件：色譜柱為Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.01 mol/L四丁基溴化銨溶液-乙腈-三乙胺（980∶20∶2，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0），流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為30℃。

LC-MS色譜條件：色譜柱為GL Sciences C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.01 mol/L醋酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃。按表1進(jìn)行線性梯度洗脫。

表1 線性梯度洗脫表Tab 1 Linear gradient elution

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正離子模式采集數(shù)據(jù)；選擇一定質(zhì)荷比（m/z）范圍內(nèi)的全掃描，m/z為100～800；氮?dú)饬魉贋?0 L/min，霧化器壓力為35 psig，干燥氣體溫度為300℃，毛細(xì)管電壓為4.0 kV。

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液制備。取比阿培南原料藥（批號：4031204001）約15 mg，置于10 ml量瓶中，加適量流動(dòng)相溶解后，于80℃水浴破壞15 min，放冷至室溫，加5%甲酸溶液0.5 ml，再加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得含有比阿培南2個(gè)開環(huán)物雜質(zhì)的溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備。取供試樣品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 ml中含1.5 mg的溶液，作為供試品溶液（臨用新制）。

2.2.3 對照溶液的制備。精密量取供試品溶液適量，加流動(dòng)相定量稀釋制成15 μg/ml的溶液，即得。

2.2.4 比阿培南開環(huán)物A定位溶液的制備。取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液繼續(xù)水浴破壞，同時(shí)增加進(jìn)樣體積，在檢測器出口處收集第1個(gè)峰面積顯著增大的雜質(zhì)的洗脫成分，即得。

2.2.5 比阿培南開環(huán)物B對照品溶液的制備。取比阿培南開環(huán)物B雜質(zhì)對照品適量，加流動(dòng)相溶解，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液破壞條件的確定

比阿培南結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定，在高溫、酸或堿條件下易開環(huán)，降解為比阿培南開環(huán)物A；且開環(huán)后產(chǎn)生的—COOH基不穩(wěn)定易脫去生成甲酸，甲酸使比阿培南開環(huán)，并與五元環(huán)上的—NH結(jié)合產(chǎn)生開環(huán)物B。因此選擇一定量的甲酸為破壞溶劑進(jìn)行試驗(yàn)。取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20 μl注入色譜儀，記錄色譜圖，主峰后峰面積顯著增大的2個(gè)雜質(zhì)峰依次為比阿培南開環(huán)物A、B。主峰與比阿培南開環(huán)物A色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。

比阿培南可能降解的途徑如圖1所示：

圖1 比阿培南開環(huán)物可能的降解途徑Fig 1 Potential degradation pathway of biapenem openring impurities

2.4 比阿培南開環(huán)物的結(jié)構(gòu)確證

取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，進(jìn)行LC-MS聯(lián)用分析，結(jié)果檢出2個(gè)較大的降解雜質(zhì)峰，保留時(shí)間約為3.8 min的雜質(zhì)準(zhǔn)分子離子峰的m/z分別為369、325，與[M+H]+、[M-COOH+H]+對應(yīng)，即m/z為369的峰分子質(zhì)量為368，與比阿培南開環(huán)物A的分子質(zhì)量368一致；m/z為325的峰為比阿培南開環(huán)物A的碎片離子，因比阿培南開環(huán)后—COOH基易脫去，形成該碎片離子；保留時(shí)間約為5.4 min處的雜質(zhì)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+的m/z為397，即m/z為397的峰分子質(zhì)量為396，與比阿培南開環(huán)物B分子質(zhì)量396一致，且其保留時(shí)間及m/z均與比阿培南開環(huán)物B對照品一致。表明系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中降解產(chǎn)生的2個(gè)較大雜質(zhì)分別為比阿培南開環(huán)物A、B，詳見圖2。

圖2 降解雜質(zhì)經(jīng)LC-MS結(jié)構(gòu)確證分析結(jié)果A.總離子流圖；B.開環(huán)物B的MS圖；C.開環(huán)物A的MS圖；1.比阿培南；2.開環(huán)物A；3.開環(huán)物BFig 2 LC-MS analysis results of structural identification of impurity by degradationA.TIC；B.MS chromatograms of open-ring impurity B；C.MS chromatograms of open-ring impurity A；1.biapenem；2.open-ring impurity A；3.open-ring impurity B

2.5 比阿培南開環(huán)物在2種色譜系統(tǒng)中的相互識別

通過對比2種色譜系統(tǒng)中雜質(zhì)含量，結(jié)果系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液在HPLC色譜系統(tǒng)中的2個(gè)峰面積顯著增大的雜質(zhì)，分別與LC-MS系統(tǒng)下峰面積顯著增大的雜質(zhì)含量基本吻合，兩者存在對應(yīng)關(guān)系；另采用開環(huán)物B雜質(zhì)對照品在HPLC色譜系統(tǒng)進(jìn)行定位，可證明第2個(gè)顯著增大的雜質(zhì)即為比阿培南開環(huán)物B；收集HPLC色譜系統(tǒng)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中第1個(gè)顯著增大雜質(zhì)的洗脫成分，再在LC-MS系統(tǒng)中進(jìn)樣測試，其保留時(shí)間與比阿培南開環(huán)物A一致，且其分子質(zhì)量為368，與比阿培南開環(huán)物A分子質(zhì)量亦一致，可證明第1個(gè)顯著增大的雜質(zhì)即為比阿培南開環(huán)物A。

由此說明，LC-MS系統(tǒng)檢出分子質(zhì)量為368和396的雜質(zhì)，分別與HPLC色譜系統(tǒng)檢出的2個(gè)雜質(zhì)為同一物質(zhì)，即HPLC色譜系統(tǒng)中此2個(gè)雜質(zhì)分別為比阿培南開環(huán)物A、B。

2.6 比阿培南開環(huán)物A、B的含量測定

2.6.1 系統(tǒng)耐用性試驗(yàn)及開環(huán)物峰位的確定。照“2.1”項(xiàng)下HPLC色譜條件，取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，分別采用Thermo Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和大連依利特ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種不同廠家色譜柱，在不同儀器上進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中開環(huán)物A與比阿培南的分離度均大于1.5，開環(huán)物B保留時(shí)間與開環(huán)物B對照品一致；且比阿培南開環(huán)物A和B均增加明顯，便于對雜質(zhì)進(jìn)行定位，方法可行，耐用性好。因此采用系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液對開環(huán)物進(jìn)行定位。

2.6.2 專屬性試驗(yàn)及開環(huán)物降解途徑考察。取比阿培南原料藥（批號：4031204001）適量，分別經(jīng)水浴和5%甲酸溶液（系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液）、高溫（80℃）、光照[（4500±500）lx]、高濕（相對濕度92.5%）及原料藥溶液經(jīng)85℃水浴破壞后制成的溶液進(jìn)樣分析；同時(shí)取比阿培南開環(huán)物B對照品適量，加流動(dòng)相制成一定質(zhì)量濃度的溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，考察方法專屬性?？瞻祝鲃?dòng)相）、開環(huán)物B對照品及樣品經(jīng)高溫、高濕、光照、水浴及強(qiáng)酸破壞后的色譜見圖3。

圖3 方法專屬性考察HPLC圖譜A.空白（流動(dòng)相）；B.樣品；C.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液；D.高溫破壞后樣品；E.光照破壞后樣品；F.高濕破壞后樣品；G.水浴破壞后樣品；H.開環(huán)物B對照品；1.比阿培南；2.開環(huán)物A；3.開環(huán)物BFig 3 HPLC chromatograms of method specificityA.blank（mobile phase）；B.sample；C.solution of system suitability test；D.sample destroyed by high temperature；E.sample destroyed by light；F.sample destroyed by humidity；G.sample destroyed by water bath；H.open-ring impurity B control；1.biapenem；2.open-ring impurityA；3.open-ring impurity B

結(jié)果表明，樣品水溶液在水浴破壞條件下，開環(huán)物A增加顯著，但未降解產(chǎn)生開環(huán)物B；經(jīng)水浴及強(qiáng)酸破壞（即系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液）后，開環(huán)物A及開環(huán)物B均增加顯著；高溫、高濕及光照條件下開環(huán)物A、B均未顯著增加，表明在此幾種條件下開環(huán)物不易產(chǎn)生。降解產(chǎn)生的開環(huán)物B雜質(zhì)與其對照品保留時(shí)間一致；空白溶劑不影響比阿培南及其開環(huán)物的檢出；各降解雜質(zhì)均能與開環(huán)物分離完全。本色譜系統(tǒng)專屬性良好。因系統(tǒng)適用性試驗(yàn)即是在酸性環(huán)境下使比阿培南水解，試驗(yàn)結(jié)果表明水解產(chǎn)物對測定無干擾，故專屬性試驗(yàn)不再考察酸堿水解對測定的干擾。

2.6.3 線性關(guān)系試驗(yàn)。精密稱取比阿培南原料藥（批號：4031204001）和比阿培南開環(huán)物B對照品適量，加流動(dòng)相溶解后，再加流動(dòng)相定量稀釋制成系列質(zhì)量濃度分別為0.077、0.155、0.309、0.464、0.773、1.237、1.546 mg/ml和 0.765、1.53、3.06、4.59、7.65、12.24、15.30、22.95 μg/ml的混合溶液，搖勻，即為線性試驗(yàn)溶液。進(jìn)樣測試，將測得的峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x）作線性回歸。結(jié)果比阿培南的線性方程為：y＝758510x－1021662（r＝0.9955）；比阿培南開環(huán)物B的線性方程為：y＝1172380x－2703（r＝0.9999）。表明比阿培南與比阿培南開環(huán)物B檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.077～1.546 mg/ml、0.765～22.95 μg/ml。

2.6.4 定量限及檢測限試驗(yàn)。取“2.6.3”項(xiàng)下線性試驗(yàn)溶液，逐步稀釋制成一定質(zhì)量濃度的溶液，進(jìn)樣測試。得比阿培南與比阿培南開環(huán)物B的定量限（信噪比約為10∶1）分別為2.1、2.3 ng，檢測限（信噪比約為3∶1）分別為0.6、0.9 ng。

2.6.5 比阿培南開環(huán)物B回收率試驗(yàn)。精密稱取比阿培南開環(huán)物B適量，加流動(dòng)相溶解并制成0.15 mg/ml的溶液，作為雜質(zhì)貯備液。再精密稱取本品9份，各約30 mg，分別置于9個(gè)20 ml量瓶中，分3組，各3份，每組分別加入精密量取的雜質(zhì)貯備液（0.15 mg/ml）1.6、2.0、2.4 ml，再加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為比阿培南開環(huán)物B回收率試驗(yàn)的供試品溶液（按比阿培南開環(huán)物B的限度為1.0%進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)）；另取雜質(zhì)貯備液適量，加流動(dòng)相制成0.015 mg/ml的溶液，作為比阿培南開環(huán)物B對照品溶液。精密量取上述供試品溶液及對照品溶液各20μl，分別注入色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果，比阿培南開環(huán)物B的平均回收率為100.5%，RSD＝0.7%（n＝3），樣品對此雜質(zhì)的測定無干擾，本方法準(zhǔn)確性良好。

2.6.6 樣品測定結(jié)果。取自制的3批比阿培南原料藥及原研品1批，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取對照溶液20 μl，注入色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主峰的峰高約為滿量程的20%；再精密量取供試品溶液和對照溶液各20 μl，分別注入色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的5倍。開環(huán)物A、B含量均采用自身對照法計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 4批樣品開環(huán)物雜質(zhì)的含量測定結(jié)果Tab 2 Content determination of open-ring impurities in 4 batches of samples

3 討論

Nan Wang等[8]建立了比阿培南及雜質(zhì)質(zhì)控的HPLC分析方法，該方法利用HPLC-二極管陣列檢測器（DAD）數(shù)據(jù)，采用二維色譜光譜相關(guān)分析技術(shù)及軟件，在無雜質(zhì)對照品的情況下，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)控分析HPLC-紫外（UV）色譜中的色譜峰與LCMS色譜圖中的色譜峰的相互識別。結(jié)果表明比阿培南水解產(chǎn)生的雜質(zhì)主要為開環(huán)物及二聚物，暫命名為比阿培南開環(huán)物A及C、比阿培南二聚物A及B。

本文則采用系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，在HPLC系統(tǒng)下即可對比阿培南開環(huán)物A及B進(jìn)行定位，不依賴于LC-MS，更適用于日常檢驗(yàn)。本文方法與文獻(xiàn)[8]方法的條件比較見表3。

綜上，本文建立的方法可對比阿培南的2個(gè)開環(huán)物雜質(zhì)進(jìn)行有效分離，方法專屬強(qiáng)、靈敏度高，可滿足雜質(zhì)測定要求，因此本法可作為比阿培南中開環(huán)物的質(zhì)控方法。同時(shí)，通過系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，對特定雜質(zhì)開環(huán)物A和B進(jìn)行定位，不需要提供雜質(zhì)對照品，操作方法簡便，并可有效保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。

表3 2種分析方法的比較Tab 3 Comparison of 2 kinds of analysis methods

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