β-catenin及C-myc在膽總管囊腫中的表達(dá)及其意義

黃順根，郭萬亮，汪健

（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院外科，江蘇蘇州，215003）

先天性膽總管囊腫（congenital choledochal cyst，CCC）是一種少見的膽道系統(tǒng)囊性或梭形擴(kuò)張畸形，目前確切的發(fā)病原因尚未完全明了，通常導(dǎo)致膽囊炎、膽管炎、膽結(jié)石等并發(fā)癥，隨著病變的進(jìn)展甚至發(fā)生膽道的惡性轉(zhuǎn)化。Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起著重要的作用，β-catenin是Wnt經(jīng)典途徑信號(hào)傳導(dǎo)過程中的重要成分，C-myc是βcatenin下游的靶基因。β-catenin及C-myc在細(xì)胞的增殖和分化的調(diào)控過程中起著重要的作用［1，2］，但有關(guān)其在人膽總管囊腫發(fā)生和發(fā)展方面的作用了解較少，尤其是在成人與兒童患者中表達(dá)是否有所差別國內(nèi)尚無相關(guān)報(bào)道。為此，我們采用免疫組化技術(shù)及Western blot法，檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵分子β-catenin及其下游靶基因C-myc在人膽總管囊腫中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步了解膽總管囊腫的演變提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集了2007年01月至2011年12月5年間在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童膽總管囊腫石蠟切塊和新鮮組織12例（兒童組）、蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院確診并接受治療的成人膽總管囊腫石蠟切塊12例（成人組），同時(shí)收集我院足月新生兒死亡病例膽總管標(biāo)本12例為對(duì)照（對(duì)照組，均排除胰膽管疾病），免疫組化染色檢測(cè)β-catenin和C-myc的表達(dá)情況，采用Western blot法，觀察C-myc蛋白在兒童組中表達(dá)情況。

1.2 試劑與儀器

主要試劑 β-catenin抗體（1∶100）、C-myc抗體（1∶300）均購自美國Prosci公司。實(shí)驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)儀器由蘇州大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)研究所提供。圖像分析系統(tǒng)采用美國Media Cybernetics公司Imagepro-Plus（IPP）6.0專業(yè)圖像分析軟件。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化檢測(cè)：β-catenin、C-myc免疫組化采用SP法進(jìn)行染色，抗原修復(fù)采用煮沸熱修復(fù)法，陽性對(duì)照由Prosci公司提供的陽性對(duì)照片，染色后均為陽性；以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，結(jié)果均為陰性。采用IPP 6.0圖像分析軟件定量分析免疫組化染色情況：400倍視野下每張切片選擇5～8個(gè)視野進(jìn)行拍片，后保存于計(jì)算機(jī)進(jìn)行專業(yè)圖像分析。圖像分析選擇的指標(biāo)參照Mady等［3］方法，主要觀察陽性染色得分（mean calculate a quick score，MQS），即陽性染色比例與平均光密度乘積。每個(gè)切片經(jīng)過圖像分析后，所得數(shù)值取平均值后即為該患者的分析指標(biāo)值。

1.3.2 Western blot法檢測(cè) C-myc蛋白表達(dá)：（1）膽總管平滑肌總蛋白提??；（2）BCA法繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)量樣品蛋白濃度；（3）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrohoresis，SDS-PAGE）變性電泳；（4）Western blot印跡；（5）轉(zhuǎn)印膜的免疫檢測(cè)：加入一抗工作液（C-myc單克隆抗體1∶300），室溫水平搖床孵育1 min；TBST室溫洗膜5 min×3次；加入二抗工作液（PBS稀釋至 1∶1 000），室溫水平搖床孵育 1 min，TBST 室溫洗膜5 min×3次；在膜表面加入新鮮配制的ECL化學(xué)發(fā)光孵育液，室溫孵育5 min；轉(zhuǎn)移至X線暗盒中曝光30 s，顯影5 min，定影5 min；根據(jù)結(jié)果調(diào)節(jié)曝光時(shí)間，再次曝光顯影；（6）結(jié)果分析：膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。以GAPDH的光密度（optical density，OD）值為參照。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法：目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=OD目的條帶/OD內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 β-catenin的表達(dá)及其圖像分析結(jié)果

在成人膽總管囊腫、兒童膽總管囊腫中，βcatenin表達(dá)呈棕褐色，染色強(qiáng)表達(dá)，在柱狀上皮呈細(xì)胞膜表達(dá)伴有部分細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核表達(dá)，在神經(jīng)叢細(xì)胞呈細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，而間質(zhì)細(xì)胞可見細(xì)胞核表達(dá)；對(duì)照組膽總管中，表達(dá)強(qiáng)度中等（圖1）。成人膽總管囊腫、兒童膽總管囊腫、以及對(duì)照組膽總管中β-catenin表達(dá)分別為1 401.514 8±267.240 6、1 653.664 4±565.094 2、990.706 7±447.731 3，3 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.018 1）。3組數(shù)據(jù)兩兩比較顯示：成人組與兒童組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.355 6）；兒童組、成人組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P分別為 0.007 9、0.028 2）。

2.2 各組C-myc表達(dá)的比較

在不同組別中，C-myc均存在陽性表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞核，呈中等程度表達(dá)，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)呈弱陽性表達(dá)（圖2）。成人組、兒童組以及對(duì)照組膽總管中C-myc表達(dá)分別為800.837 6±378.740 6、1 822.167 3±1 301.414 4、933.537 3±494.420 7。3 組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.039 3）。兩兩比較結(jié)果顯示：成人組與兒童組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.020 9）；兒童組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.030 3）；成人組與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.603 3）。

2.3 C-myc的Western blot檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，兒童組和對(duì)照組C-myc蛋白表達(dá)量分別為 1.007 0±0.662 9、0.426 3±0.102 1，經(jīng)秩和檢驗(yàn)比較，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-2.408 7，P=0.016 0，圖3）。

圖1 各組β-catenin表達(dá)比較×400Fig.1 β-catenin expression in the groups×400

圖2 各組cmyc表達(dá)情況比較400Fig.2 c-myc expression in three groups×400

圖3 兒童CCC組與對(duì)照組Westernblot結(jié)果比較Fig.3 Comparison of Western blot results of C-myc between thechildren group and the control group

3 討論

膽總管囊腫是一種少見的膽道系統(tǒng)的囊性或梭形擴(kuò)張畸形。有關(guān)該疾病的病因?qū)W說很多，其中最為廣泛接受的說法是胰膽管合流異常（pancreaticobiliary maljunction，PBM），該學(xué)說認(rèn)為膽總管與胰管匯合于十二指腸外，且共同管過長［4］，而生理情況下胰管內(nèi)的壓力較膽總管為高，因此導(dǎo)致胰液返流入膽總管，產(chǎn)生炎性反應(yīng)并造成膽總管壁破壞進(jìn)而發(fā)生擴(kuò)張［5］。有研究顯示β-catenin和C-myc在發(fā)育、基因調(diào)節(jié)以及腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用，但在CCC患者中有關(guān)β-catenin和C-myc表達(dá)及其分子機(jī)制國內(nèi)尚未見報(bào)道。由于膽總管囊腫的形成可能也存在膽道上皮的異常增殖，研究β-catenin和C-myc在膽總管囊腫中的表達(dá)，有助于了解膽總管囊腫惡性轉(zhuǎn)化過程中的相關(guān)機(jī)制。

β-catenin在不同年齡膽總管囊腫中的表達(dá)及其意義為β-catenin是原癌基因編碼的蛋白質(zhì)，人類β-catenin的基因定位于染色體3q21，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)中未被激活的β-catenin被磷酸化而啟動(dòng)泛素系統(tǒng)，進(jìn)而經(jīng)蛋白酶體途徑降解［6］。β-catenin有兩種主要的功能，一是作為細(xì)胞間的黏附分子維持上皮細(xì)胞間的黏附；另外一種重要的功能是βcatenin作為Wnt信號(hào)通路的一部份，參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)［1］。當(dāng) Wnt與其受體 Frizzled 蛋白（Fz）結(jié)合時(shí)，可以抑制蛋白激酶GSK-3的活性。而GSK-3和Axin以及APC組成的復(fù)體可以使β-catenin產(chǎn)生磷酸化，促進(jìn)其自身的降解，在GSK-3的活性受到抑制的情況下，可以使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚，從而使之可以進(jìn)入細(xì)胞核與TCF和LEF結(jié)合以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［7］。

本研究采用免疫組化檢測(cè)不同標(biāo)本膽總管囊腫β-catenin的表達(dá)情況，在表達(dá)強(qiáng)度方面，可見成人膽總管囊腫和兒童膽總管囊腫中β-catenin的表達(dá)呈強(qiáng)表達(dá)，而在對(duì)照組中，表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)較弱。免疫組織化學(xué)圖像分析顯示成人膽總管囊腫、兒童膽總管囊腫中的β-catenin表達(dá)與對(duì)照組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而成人膽總管囊腫和兒童膽總管囊腫兩者之間β-catenin表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示β-catenin在膽總管囊腫進(jìn)展中發(fā)揮一定作用。Kimura等［8］報(bào)道1組膽道腫瘤患者，研究結(jié)果顯示β-catenin蛋白的亞細(xì)胞定位與腫瘤的大小、患者的年齡、PBM合并與否無顯著性差異，然而β-catenin的亞細(xì)胞定位在所有患者中具有顯著性差異，亞細(xì)胞定位依賴于腫瘤的分級(jí)，其研究結(jié)果提示膽囊癌發(fā)生過程中，β-catenin可能通過Wnt經(jīng)典信號(hào)途徑起一定的作用。在本研究中，無論是成人膽總管囊腫還是兒童膽總管囊腫，其β-catenin的表達(dá)均高于對(duì)照組。膽總管囊腫患者發(fā)生癌變的高風(fēng)險(xiǎn)，可能提示β-catenin的過表達(dá)在膽總管囊腫癌變發(fā)生與發(fā)展中起到重要的作用。但本組中兒童患者βcatenin表達(dá)較成人組更高，提示兒童膽總管囊腫上皮破壞嚴(yán)重，惡性轉(zhuǎn)化潛能更高，可能由于胰膽管返流更加嚴(yán)重所致。因此有必要早期采取手術(shù)治療，以防膽道惡性轉(zhuǎn)化。

C-myc是β-catenin下游的靶基因，在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有組均存在C-myc陽性表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈中等程度表達(dá)。兒童膽總管囊腫組C-myc表達(dá)較成人組與對(duì)照組明顯增高（P＆lt;0.05），可能是因?yàn)閮和懣偣苣夷[患者合并胰膽管合流異常、胰膽管返流嚴(yán)重所致，提示C-myc可能在兒童膽總管囊腫的演變中具有一定的意義。成人膽總管囊腫患者以膽管炎和胰腺炎的表現(xiàn)居多，而兒童膽總管囊腫中，以黃疸和腹部腫塊更為常見［10］，提示兒童患者囊腫內(nèi)壓力及膽道受阻情況比成人更加嚴(yán)重，這可能也是造成兒童膽總管囊腫壁纖維化較成人更加嚴(yán)重的原因之一，膽汁排出受阻更為嚴(yán)重，膽道上皮破壞更為嚴(yán)重，可能是導(dǎo)致C-myc表達(dá)較高的原因之一。成人膽總管囊腫C-myc表達(dá)和對(duì)照組相當(dāng)，可能與兩者都處在一個(gè)較高的表達(dá)水平上有關(guān)。同時(shí)因?yàn)闃?biāo)本來源限制，本試驗(yàn)無法確定正常成人膽總管C-myc的表達(dá)水平，因此出現(xiàn)成人膽總管囊腫與對(duì)照組（足月新生兒）膽總管C-myc表達(dá)無差異的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)也證實(shí)了兒童膽總管囊腫C-myc表達(dá)較對(duì)照組顯著增高。這一結(jié)果也進(jìn)一步提示了C-myc在膽總管囊腫進(jìn)展中扮演了重要角色。有學(xué)者認(rèn)為［11，12］C-myc在腫瘤的發(fā)生中起到重要的作用，該基因的易位重排及擴(kuò)增是很多腫瘤產(chǎn)生的原因。本研究中可見兒童膽總管囊腫患者明顯存在C-myc的高表達(dá)，結(jié)合前述β-catenin表達(dá)同時(shí)增高，這種高表達(dá)提示W(wǎng)nt經(jīng)典信號(hào)途徑在兒童膽總管囊腫的進(jìn)展中可能發(fā)揮一定作用，由此推測(cè)其可能是膽總管囊腫的癌變可能機(jī)制之一。

綜上所述，本研究結(jié)果提示β-catenin在兒童和成人膽總管囊腫患者中表達(dá)明顯增高，β-catenin可能在膽總管囊腫惡性轉(zhuǎn)化中起一定作用，而C-myc在兒童膽總管囊腫表達(dá)較成人組顯著增高，提示經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑可能在兒童膽總管囊腫的進(jìn)展和惡性轉(zhuǎn)化過程起到一定作用。

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