大鼠心肌缺血再灌注早期心肌及血清中IL-6、TNF-α的表達

鄒吉麗，尹照萍，張利群，王永權(quán)，齊國先

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110001；2.寬甸縣中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 寬甸 118200；3.遼寧盤錦遼河油田婦嬰醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 盤錦 124010；4.沈陽醫(yī)學(xué)院人文教研室，沈陽 110034）

近年來炎癥學(xué)說備受重視，炎癥在冠心病的發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后中起重要的作用。過度的炎性反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷的主要機制之一，如白細胞滲出、水腫、組織壞死及炎性細胞因子的釋放。主要表現(xiàn)為促炎因子釋放增加，其中白細胞介素6（interlukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）占主導(dǎo)位置［1］。而確定缺血再灌注損傷早期炎性細胞因子的動態(tài)變化，觀察其變化規(guī)律及峰值出現(xiàn)時間對應(yīng)用炎性因子抑制劑有積極的指導(dǎo)作用，可進一步有效控制炎癥、保護心肌。本研究應(yīng)用缺血再灌注模型，研究缺血再灌注早期占主導(dǎo)地位的細胞因子IL-6、TNF-α的表達情況，觀察其動態(tài)變化規(guī)律及峰值出現(xiàn)時間。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Wistar大鼠98只，體質(zhì)量260～300 g，由中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。分籠飼養(yǎng)于恒溫（20±2）℃、恒濕（50%～60%）、無特殊病原體條件下，飲用水和標準飼料均經(jīng)滅菌后供動物自由取用。將大鼠隨機分為缺血再灌注組：根據(jù)大鼠再灌注時間不同分為7個小組，缺血（45 min）再灌注15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h 組，每組 8 只大鼠；假手術(shù)組：開胸穿線不結(jié)扎，按照再灌注時間又分7個小組，每組6只大鼠。

1.2 主要實驗試劑及儀器

ELASA試劑盒（美國R＆amp;D公司）、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（南京建成科技有限公司，批號：090828）、心電圖機（上海光電儀器有限公司）、動物人工呼吸機（上海嘉鵬科技有限公司）、石蠟切片機（德國LEICA公司）、高速冰凍離心機（德國Sigma公司）、光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、低溫冰箱（日本SANYO公司）、ELX-800型酶標儀（美國Bio-tek公司）。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備

大鼠用10%水合氯醛0.04 L/kg腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，氣管切開插管行小動物呼吸機輔助呼吸，潮氣量 0.002～0.003 L，吸呼比 1∶1.5，呼吸頻率75次/min。經(jīng)左前胸第3、4肋間開胸，打開心包，擠出大部分心臟，暴露心臟及左心耳，以5/0線在距冠狀動脈前降支根部1～2 mm系1個袢，其間穿過1根塑料管，拉緊袢，觀察心電圖變化，ST抬高為結(jié)扎成功，結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗。45 min后拔出塑料管，使冠狀動脈血流再通，再灌時局部組織充血。分別于再灌注 15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h，先從右心房取血0.002～0.003 L，注入清潔干燥玻璃試管內(nèi)，待血液凝固后立即放入離心機3 000 r/min（4℃），離心15 min，取上清液，即得血清標本，-80℃保存待測。取前降支結(jié)扎線下2 mm至心尖部左心室缺血心肌組織100 mg，搗碎組織，按1 mg/L加入含蛋白酶抑制劑與細胞裂解液的混合物4°C過夜后，20 000 r/min離心20 min。取上清于-80℃保存待測。假手術(shù)組在心臟同樣部位穿線但不結(jié)扎LAD，于相同時間點相同方法采集標本。

1.4 血清及心肌組織中IL-6、TNF-α含量檢測

1.4.1 血清IL-6、TNF-α水平測定：將試劑盒平衡至室溫，加入標準品和待測樣品，繪制標準曲線。溫育、洗滌、顯色、終止，以空白孔調(diào)零450 nm波長依序測量各孔的吸光度（optical density，OD），計算IL-6、TNF-α的含量。

1.4.2 心肌組織中IL-6、TNF-α含量測定：標本均采用ELISA法檢測，操作過程同血清內(nèi)細胞因子檢測，同時用考馬斯亮藍蛋白測定法檢測每個組織標本的蛋白含量，得出數(shù)值后，將勻漿液中的細胞因子含量（/mL）換算成蛋白中的細胞因子含量（/mg）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6含量比較

如表1、表2所示，在假手術(shù)組中，大鼠心肌組織中各時間點TNF-α、IL-6含量無明顯變化（P＆gt;0.05）。在缺血再灌注組，TNF-α和IL-6含量再灌注15 min時開始增高，2 h達高峰，4～6 h逐漸下降，24 h略有回升。與假手術(shù)組各對應(yīng)時間比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＆lt;0.01）。

表1 心肌組織中TNF-α含量比較（±s，pg/mg）Tab.1 Comparison of content of TNF-αin myocardial tissue（±s，pg/mg）

表1 心肌組織中TNF-α含量比較（±s，pg/mg）Tab.1 Comparison of content of TNF-αin myocardial tissue（±s，pg/mg）

1）P＆lt;0.01 vs sham group.

Group TNF-α 15 min 30 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h I/R 17.61±2.081） 21.75±2.761） 33.56±3.311） 40.23±3.231） 39.35±3.051） 20.55±2.661） 23.77±3.361）Sham 12.61±1.94 14.12±1.70 13.56±1.72 12.96±1.91 13.85±1.27 12.96±2.14 13.71±2.18

表2 心肌組織中IL-6含量比較（±s，pg/mg）Tab.2 Comparison of content of IL-6 in myocardial tissue（±s，pg/mg）

表2 心肌組織中IL-6含量比較（±s，pg/mg）Tab.2 Comparison of content of IL-6 in myocardial tissue（±s，pg/mg）

1）P＆lt;0.01 vs sham group.

Group IL-6 15 min 30 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h I/R 16.34±2.181） 21.23±3.661） 33.54±3.661） 39.24±3.621） 38.15±3.831） 18.93±3.051） 21.93±2.751）Sham 14.48±1.75 15.20±2.02 14.60±1.72 15.56±2.10 15.40±1.73 14.51±2.03 13.68±2.41

2.2 各組大鼠血清不同時間點TNF-α、IL-6含量比較

在假手術(shù)組中，TNF-α、IL-6各時間點比較無明顯變化（P＆gt;0.05）。在缺血再灌注組血清中TNF-α、IL-6再灌注15 min增高，之后持續(xù)升高，2 h達高峰，6 h有所下降，24 h略有升高。與假手術(shù)組相同時間點比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＆lt;0.01）。見表3、4。

表3 血清中TNF-α含量比較（±s，ng/mL）Tab.3 Comparison of content of TNF-αin serum（±s，ng/mL）

表3 血清中TNF-α含量比較（±s，ng/mL）Tab.3 Comparison of content of TNF-αin serum（±s，ng/mL）

1）P＆lt;0.01 vs sham group.

TNF-α 15 min 30 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h I/R 1.92±0.251） 2.46±0.391） 3.58±0.431） 3.93±0.451） 3.85±0.471） 2.25±0.271） 2.56±0.421）Sham 1.45±0.18 1.51±0.23 1.49±0.19 1.53±0.27 1.56±0.23 1.49±0.21 1.38±0.21 Group

表4 血清中IL-6含量比較（±s，pg/mg）Tab.4 Comparison of content of IL-6 in serum（±s，pg/mg）

表4 血清中IL-6含量比較（±s，pg/mg）Tab.4 Comparison of content of IL-6 in serum（±s，pg/mg）

1）P＆lt;0.01 vs sham group.

IL-6 15 min 30 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h I/R 198.3±28.321） 255.2±28.191） 367.8±30.221） 402.1±29.081） 400.3±22.201） 225.3±18.361） 257.8±21.461）Sham 144.9±18.15 151.7±15.24 145.6±21.66 155.3±18.74 154.7±15.98 146.1±17.84 139.4±17.60 Group

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是指原缺血心肌恢復(fù)血供后發(fā)生更為嚴重的損傷，表現(xiàn)為再灌注心律失常、無復(fù)流、心肌頓抑、微循環(huán)障礙、猝死等。心肌缺血再灌注存在較復(fù)雜的機制，在這過程中，心肌中TNF-α含量明顯增加。TNF-α是分子量為17 kDa的可溶性多肽，以二聚體、三聚體或五聚體的形式存在于溶液中，它在機體處于應(yīng)激狀態(tài)時由激活的單核細胞、巨噬細胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，參與體內(nèi)腫瘤細胞的殺傷、調(diào)節(jié)細胞的增殖及體內(nèi)的免疫代謝等作用，也參與炎性反應(yīng)、介導(dǎo)休克、組織損傷等病理生理反應(yīng)［1，2］。TNF-α 可激活細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，促進氧自由基產(chǎn)生、活化中性粒細胞、誘導(dǎo)心肌細胞凋亡等，加重心肌缺血再灌注損傷。TNF-α產(chǎn)生的具體機制主要包括［3］：（1）過氧化氫誘導(dǎo)的 p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信號通路，近年來發(fā)現(xiàn)該通路為一類新的MAPK通路，不但在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，而且參與細胞的存活、分化和凋亡等過程。再灌注過程可激活p38 MAPK，使細胞因子產(chǎn)生增多，其中包括TNF-α。（2）心肌缺血再灌注過程可激活核因子 κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB），NF-κB 在TNF-α產(chǎn)生的過程中起重要作用。激活NF-κB后，kB 抑制蛋白（inhibition-kappa B，I-κB）磷酸化，導(dǎo)致NF-κB-I-κB 復(fù)合物分裂和 I-κB 的降解。NF-κB 一旦從I-κB中裂解出來，就從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核，并與4個NF-κB結(jié)合位點中的1個位點相結(jié)合而定位于 DNA。I-κB 被 MAPKs磷酸化并激活 NF-κB，轉(zhuǎn)位到細胞核，激活TNF-α基因啟動轉(zhuǎn)錄。在此過程中，TNF-α通過與靶細胞膜上TNF受體結(jié)合，活化的TNF-α受體通過一系列的反應(yīng)，激活細胞內(nèi)的信號蛋白，如 Caspases、p38 MAPK 等，導(dǎo)致 Apo-1、NF-κB活化，啟動基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細胞分化、存活和死亡［3］。因此阻斷TNF-α的產(chǎn)生，抑制其活化就可減輕缺血再灌注損傷的發(fā)生。

IL-6由多種細胞產(chǎn)生，主要由活化的中性粒細胞產(chǎn)生，也可由內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞產(chǎn)生，活化的單核細胞是血液中IL-6的主要來源，局部組織的IL-6主要由成纖維細胞或局部巨噬細胞產(chǎn)生。IL-6是分子量19～28 kDa的糖蛋白，人IL-6前體為212肽，包括一段28肽的信號肽，成熟的IL-6含184個氨基酸殘基，轉(zhuǎn)錄后修飾時有N糖基化、O糖基化和磷酸化。對免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、造血和神經(jīng)系統(tǒng)有多方面的作用。在病理狀態(tài)下，細胞因子IL-6會出現(xiàn)異常表達，表現(xiàn)為IL-6及其受體的缺陷、IL-6表達過高以及可溶性細胞因子受體的水平增加等［4］。研究表明，心肌細胞產(chǎn)生IL-6主要由缺血及再灌注誘導(dǎo)［5］。IL-6處于炎癥調(diào)控的樞紐位置，可誘導(dǎo)中性粒細胞內(nèi)流入缺血心肌組織，刺激中性粒細胞、心肌細胞表面分別表達CDllb/CDl8及細胞間黏附分子1，介導(dǎo)與心肌細胞結(jié)合，損傷心肌。目前已知，炎性細胞因子一方面能夠引起心肌收縮力下降，同時也能促使心肌細胞肥大、誘導(dǎo)心肌細胞表達胚胎型蛋白、促進細胞凋亡及心肌細胞外基質(zhì)發(fā)生改變，動物實驗證實心肌梗死后激活免疫系統(tǒng)而發(fā)生的自身免疫反應(yīng)也是導(dǎo)致心肌細胞喪失的原因之一［6］。心肌梗死后，細胞因子明顯表達，在急性冠脈綜合征早期干預(yù)治療的過程中［7］，特別是在缺血再灌注損傷的保護機制中，炎性細胞因子起著明顯的反面作用。研究表明［7］，細胞因子參與冠狀動脈硬化形成過程。動物實驗亦證實心肌梗死后因免疫系統(tǒng)激活而發(fā)生的自身免疫反應(yīng)也是導(dǎo)致心肌細胞喪失的原因之一［6］。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷早期細胞因子IL-6、TNF-α明顯表達，并呈動態(tài)變化，再灌注15 min，TNF-α、IL-6 已增高，2～4 h 達峰值，4 h 后逐漸下降，可以觀察到，血清與心肌組織中炎性細胞因子的表達濃度、動態(tài)變化基本相同。但通過觀察外周血炎性細胞因子的變化和濃度是否可以來判斷組織的損傷時間及程度還需要我們進一步研究和探討。

綜上所述，本研究探討了缺血再灌注損傷早期炎性細胞因子的表達及規(guī)律，為早期應(yīng)用炎性細胞因子抑制劑、進一步保護心肌提供理論依據(jù)，但其具體機制及更有效的藥物及給藥方法還需要我們進一步的研究和探討。

［1］劉保江.丙泊酚對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷時NF-κB、TNF-α及IL-6表達的影響［D］.山西醫(yī)科大學(xué)，2007.

［2］Morgan MJ，Kim YS，Liu ZG.TNF-alpha and reactive oxygen species in necrotic cell death［J］.Cell Res，2008，18（3）：343-349.

［3］Bartee E，Mohamed MR，McFadden G.Tumor necrosis factor and interferon：cytokines in harmony［J］.Curr Opin Microbiol，2008，11（4）：378-383.

［4］Dhingra S，Sharma AK，Slngla DK，et al.P38 and ERKI/2MAPKs mediate the interplay of TNF-alpha and IL-10 in regulating oxidative stress and cardiac myoyte apoptosis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293（6）：H3524-3531.

［5］齊曉云，徐萍，李春華，等.血漿組織因子及其途徑抑制物對急性心肌梗死患者雷帕霉素支架置入后血栓形成的影響［J］中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，40（7）：639-641.

［6］谷高玲，趙國安，孫海燕，等.冠心病患者細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑 1基因多態(tài)性的臨床意義［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，42（5）：436-438.

［7］Chao W.Toll-like receptor signaling：a critical modulator of cell survivalandischemicinjuryintheheart［J］.AmJPhysiolHeartCircPhysiol，2009，296（1）：H1-12.