抑制瘤胃甲烷排放的酵母菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

公衍玲， 廖新俤

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642)

益生菌可通過直接飼喂來調(diào)節(jié)宿主動物的腸道菌群平衡，進而提高生產(chǎn)性能、改變瘤胃發(fā)酵和提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[1]。直接飼喂微生物中最常見的真菌培養(yǎng)物是釀酒酵母和米曲霉，目前酵母菌在反芻動物飼料中應用比較廣泛。研究發(fā)現(xiàn)酵母菌還具有抑制瘤胃甲烷排放的作用[2]，且作用機制已有大量研究：增加丙酸和丁酸的含量[3]；減少原蟲動物的數(shù)量[4]；增加產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量[5]。甲烷是反芻動物瘤胃正常消化的產(chǎn)物，但其排放不僅對空氣環(huán)境造成污染，增加溫室效應，并且造成飼料能量的損失。因此，減少反芻動物瘤胃內(nèi)甲烷的生成量對提高飼料能量利用率和改善環(huán)境都具有重要的意義。Newbold 和Rode[6]研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)甲烷的調(diào)控具有很強的菌株效應，有些菌株無調(diào)控效應，有些菌株可使甲烷的產(chǎn)量降低58%。因此，本研究以酒、面包和畜禽專用酵母為原料，分離到了3株酵母菌，然后通過體外發(fā)酵試驗，從中篩選到1株抑制瘤胃甲烷排放效果最為顯著的酵母菌YST 3，并以此為研究對象，對該菌株進行了分子生物學鑒定；測定了其生長曲線；并對其發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。旨在初步篩選抑制瘤胃甲烷排放的酵母菌株，并優(yōu)化其最佳培養(yǎng)條件，為下一步直接添加研究其調(diào)控瘤胃甲烷排放效果及相關機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要材料 用于菌種分離的酒和面包均購自馬來西亞吉隆坡的農(nóng)貿(mào)市場。畜禽專用活性干酵母，購自安琪酵母股份有限公司，活菌數(shù)≥200億個/克。瘤胃液采自經(jīng)長期穩(wěn)定飼養(yǎng)且安裝永久性瘺管的2 頭泌乳荷斯坦奶牛，39 ℃恒溫密封保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉，pH值自然，121℃蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑 0.9 %生理鹽水：NaCl0.9 g，加蒸餾水定容至100 mL。

常量元素溶液：Na2HPO45.7 g；KH2PO46.2 g；MgSO4·7H2O 0.6 g，加去離子水定容至1 000 mL。

微量元素溶液：CaCl2·2H2O 13.2 g；MnCl2·4H2O 10.0 g；CoCl2·6H2O 1.0 g；FeCl2·6H2O 0.8 g，加去離子水定容至100 mL。

緩沖溶液：NH4HCO34.0 g；NaHCO335.0 g，加去離子水定容至1 000 mL。

刃天青溶液0.1%(w/v)：刃天青100 mg，溶解于100 mL去離子水中。

還原劑溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，1N NaOH 2.0 mL；Na2S·7H2O 285 mg；加去離子水定容至50 mL。

DNA抽提試劑盒：i-genomic BYF DNA Mini Kit，Omega公司，美國。

膠回收試劑盒：E.Z.N.A Gel Extraction kit，Omega公司，美國。

1.1.4 試驗設備 超凈工作臺(AIRTECH)，高壓蒸汽滅菌鍋，凍干機(CHRIST)，ZHWY-2102C系列震蕩培養(yǎng)箱，7200型紫外可見分光光度計，100 mL 玻璃注射器(HBERLE, 德國)，水浴搖床(SHA-B)，島津GC-2010型氣相色譜儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離 以無菌操作取酒/面包/安琪畜禽專用活性干酵母樣10 mL/10 g/10 g，放于裝有90 mL滅菌生理鹽水(0.9 %)的滅菌三角瓶瓶內(nèi)，充分混勻制成1∶10的均勻稀釋液。用1 mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1 mL，沿瓶壁緩緩注入含有9 mL滅菌生理鹽水的滅菌三角瓶瓶內(nèi)，混合均勻，制成1：100的稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按上項操作順序，制成10倍遞增稀釋液(10-2to 10-6)。從每個稀釋液中分別取100 μL，對號接種在不同稀釋度編號的YPD固體培養(yǎng)基平板上(每個編號設三個重復)。將平板倒轉，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。待培養(yǎng)基上長出明顯菌落后，每組分別挑取20個具有典型酵母菌菌落特征的單菌落，接種于YPD固體培養(yǎng)基平板上，再培養(yǎng)72 h，獲得純培養(yǎng)樣品。

挑取純培養(yǎng)樣品的單菌落，接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、175 r/min震蕩培養(yǎng)48 h。取擴大培養(yǎng)的菌液，9 600 g離心10 min，去掉上清液，細胞沉淀用雙蒸水清洗2次。收集細胞沉淀，凍干機冷凍制成凍干粉，分別標記為YST1(安琪酵母樣)、YST2(酒樣)和YST3(面包樣)，每克凍干粉含有的活菌數(shù)約為1.8 × 1010CFU。

1.2.2 菌株鑒定 收集4 mL純培養(yǎng)酵母樣品，采用i-genomic BYF DNA Mini Kit抽提DNA，用于18s rRNA擴增。基因上游引物ITS 1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG-3')，基因下游引物 ITS 2(5'-GCT GCG TTC TTC TTG ATC GAT GC-3')。50 μL PCR反應體系：2 μL DNA 模板，2.0 μL 上/下游引物，4.0 μL dNTPs，1.0 μL EX Taq，5.0 μL 10 × buffer和 34.0 μL ddH2O?；旌暇鶆蚝?，按以下條件進行PCR反應：95℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72℃ 45 s ，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應結束后，50 μL PCR 產(chǎn)物進一步用E.Z.N.A Gel Extraction kit進行膠回收，將膠回收產(chǎn)物送往北京奧萊博生物技術有限責任公司測序，序列的遺傳多樣性采用DNAMAN 4.0軟件進行分析。

1.2.3 體外發(fā)酵 以500 mg蘇丹草作發(fā)酵底物，采集經(jīng)長期穩(wěn)定飼養(yǎng)且安裝永久性瘺管的2 頭泌乳荷斯坦奶牛瘤胃液做發(fā)酵菌源，接種液的配制參照Menke和Steingass[7]，將發(fā)酵菌源與接種液按照1∶2比例混合均勻，即為體外發(fā)酵液(30 mL/支注射器)，厭氧保存。體外發(fā)酵裝置為100 mL的玻璃注射器(HBERLE, 德國)，用前用凡士林潤滑活塞。

采用單因素試驗設計將試驗分為4個處理：對照組、YST 1組、YST 2組及YST 3組。對照組未添加酵母粉，活性干酵母組的酵母粉添加劑量為：0.2 mg/mL發(fā)酵液。每個處理6個重復，每個重復3支注射器。于39℃水浴搖床中60 r/min培養(yǎng)24h。

記錄第0 h的活塞位置讀數(shù)，根據(jù)活塞位置記錄累積產(chǎn)氣量。第24 h終止發(fā)酵，用50 mL注射器采集氣樣，轉移至氣體采樣袋中，用島津GC-2010型氣相色譜儀測定甲烷濃度，條件是：色譜柱為美國AgilentHP-PLOT Q毛細柱，長30 mm、內(nèi)徑0.32 mm、薄膜厚度0.25 μm、柱溫50 ℃，進樣口SPL溫度250 ℃，檢測器FID溫度250 ℃。壓力92.8 kPa，空氣流量400 mL/min；氫氣流量40 mL/min，氮氣(載氣)流量60 mL/min，進樣體積200 μL，分流比6∶1。篩選抑制瘤胃甲烷排放效果顯著的酵母菌株。

1.2.4 生長曲線測定 以2%的接種量(體積分數(shù)，下同)將釀酒酵母菌株YST 3接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中(pH 5.5)，30℃、175 r/min震蕩培養(yǎng)，每隔4 h取菌體懸浮液5 mL，以未接種的酵母YPD液體培養(yǎng)基校正7200型紫外可見分光光度計的零點，測定菌液的OD600值，至OD600變化趨緩為止。根據(jù)酵母菌CFU數(shù)(涂布平板法)和OD600繪制酵母的生長曲線[8-9]。

1.2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化 培養(yǎng)溫度。以2%的接種量將對數(shù)生長期的酵母種子液YST 3接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基中(pH 5.5)，分別在25、30、35、40℃下，175 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后測定菌液的OD600值，確定酵母生長的最適溫度。

pH。以2%的接種量將對數(shù)生長期的酵母種子液YST 3接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌液pH分別為4.5、5.0、5.5(自然配置)、6.0、6.5、7.0，30℃、175 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后測定菌液的OD600值，確定酵母生長的最適pH。

葡萄糖濃度。分別調(diào)節(jié)50 mL YPD液體培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度為2.0、3.0、4.0、5.0 %，30 ℃、175 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后測定菌液的OD600值，確定釀酒酵母YST 3生長的最適葡萄糖濃度。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株鑒定

用DNAMAN 4.0軟件對三株酵母菌(YST 1 分離自畜禽專用活性酵母；YST 2 分離自酒中；YST 3 分離自面包中)的部分18s rRNA序列(411 bp)進行同源性分析(見圖1)，結果發(fā)現(xiàn)，三株酵母菌均屬于釀酒酵母，且具有91%的同源性；從酒和面包中分離得到的2株酵母與從畜禽專用活性干酵母粉中分離得到的釀酒酵母具有72%的同源性。

2.2 抑制產(chǎn)甲烷作用

三種酵母菌24 h發(fā)酵的累計產(chǎn)氣量結果見圖2。從圖2可以看出，發(fā)酵24 h畜禽專用釀酒酵母YST 1組的總產(chǎn)氣量最高，從酒中分離的釀酒酵母YST2次之，從面包中分離的釀酒酵母YST3最低。發(fā)酵24 h添加酵母組的總產(chǎn)氣量均高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。推斷添加酵母菌可能提高瘤胃的整體發(fā)酵水平，從而提高了總產(chǎn)氣量。

從圖3可以看出，與對照組相比，處理組均降低了發(fā)酵24 h的甲烷產(chǎn)量。YST 1和YST 2添加組的甲烷產(chǎn)量分別下降4.5%和3.7%(P>0.05)；YST3添加組的甲烷產(chǎn)量下降14.6%(P<0.05)。和對照組相比，YST3顯著降低了甲烷的產(chǎn)量，而總產(chǎn)氣量變化不大，推斷YST3可能通過增加瘤胃發(fā)酵過程中的丙酸含量；抑制原蟲產(chǎn)甲烷菌的繁殖，以及增加產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量等途徑降低甲烷的產(chǎn)量，但對干物質(zhì)的消化率沒有影響。

圖1酵母菌株鑒定
Fig. 1 Identification of the yeasts

圖2 體外發(fā)酵24 h總產(chǎn)氣量Fig. 2 Total gas production after 24h in vitro incubation

圖3 體外發(fā)酵24 h甲烷產(chǎn)量Fig. 3 Methane production after 24h in vitro incubation

2.3 釀酒酵母的生長曲線

釀酒酵母YST 3的生長曲線見圖4,由圖4可以看出，在前8 h酵母生長處于停滯期，在8～24 h酵母菌處于對數(shù)生長期，在培養(yǎng)24 h后，釀酒酵母活菌數(shù)達到最大，之后生長趨于穩(wěn)定，因此可選擇培養(yǎng)24 h的酵母作為接種液。

2.4 釀酒酵母生長條件的優(yōu)化結果

釀酒酵母YST 3菌株生長的最適溫度見圖5?？梢钥闯?，當溫度從25 ℃升到30 ℃時菌液的OD600nm值逐漸升高，溫度繼續(xù)升高，菌液的OD600nm值緩慢下降，而當溫度高于35 ℃時OD600nm急劇下降，推斷高溫可能影響了該菌液的代謝酶活性，從而降低其生長量?？梢娽劸平湍竃ST 3的最適生長溫度為30 ℃。

圖4 釀酒酵母生長曲線 Fig. 4 The growth curve of Saccharomyces cerevisiae

圖5 溫度對釀酒酵母生長的影響Fig. 5 Effect of tempreture on the growth of saccharomyces cerevisiae

培養(yǎng)基起始pH對釀酒酵母生長的影響見圖6。圖6結果表明當pH由4.5升高到5.5時，菌液的OD600nm增大，之后隨pH的增大菌液的OD600nm逐漸下降。絕大多數(shù)酵母生長的最佳pH范圍為4～6[10]，pH>6時，菌體生長量顯著降低。可見釀酒酵母YST3的最佳pH為5.5。

培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖對酵母生長情況的影響見圖7。該圖結果表明當葡萄糖濃度為4.0%時菌株的生長量最大，其OD600nm最高。當葡萄糖濃度低于4%時，菌株生長所需糖量不足，菌體生長量下降；高濃度葡萄糖會造成酵母細胞失水，菌體生長亦受到抑制。

圖6 pH對釀酒酵母生長的影響
Fig. 6 Effect of pH on the growth of saccharomyces cerevisiae

圖7葡萄糖濃度對釀酒酵母生長的影響
Fig. 7 Effect of concentration of glucose on the growth of saccharomyces

3 結 論

本實驗通過體外產(chǎn)氣法篩選到了一株顯著抑制瘤胃甲烷排放的釀酒酵母YST3。對其生長曲線和生長條件進行初步研究發(fā)現(xiàn)，該釀酒酵母菌的對數(shù)生長期為8～24 h，最適生長溫度和pH 分別為30℃和5.5，當培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為4.0%時可獲得最大生長量。

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