• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    川芎嗪對CIA大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達(dá)及血清VEGF、IL-17和IL-23水平的影響*

    2013-12-01 02:28:56張松峰母傳賢沈永杰
    中國病理生理雜志 2013年7期
    關(guān)鍵詞:血清

    田 華, 張松峰, 蘆 琨, 母傳賢, 沈永杰

    (商丘醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校1生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,2臨床醫(yī)學(xué)系,河南商丘476100)

    類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病,其主要病理特點(diǎn)是滑膜細(xì)胞增生,襯里層增厚,多種炎癥細(xì)胞浸潤,血管翳形成,以及軟骨和骨組織破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失,但其確切機(jī)制目前未明。近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子[1]網(wǎng)絡(luò)失衡和基質(zhì)金屬蛋白酶[2]在RA的發(fā)生、炎癥遷延、關(guān)節(jié)的破壞中占有重要的地位。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)有抗腫瘤血管生成作用[3],并能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和抗炎作用早已得到證實(shí),但是其機(jī)制還不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)在成功地建立膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型的基礎(chǔ)上,通過檢測大鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors,VEGF)、白細(xì)胞介素 17(interleukin 17,IL-17)和白細(xì)胞介素23(interleukin 23,IL-23)水平以及足爪皮下組織中基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)的表達(dá),探討TMP治療 CIA大鼠的可能機(jī)制,為臨床使用TMP治療RA提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    材料和方法

    1 動物

    Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,雌雄各半,重約(180±20)g,購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號為SCXK(鄂)2012-0007。

    2 主要試劑

    磷酸川芎嗪片,無錫市第七制藥廠生產(chǎn),規(guī)格:50 mg×100片,批號為030201;地塞米松鹽酸注射液(5 g·L-1)購自河南確山龍淵藥業(yè)有限公司。弗氏完全佐劑和雞Ⅱ型膠原由上海本草生物醫(yī)學(xué)工程所提供;多聚賴氨酸,Sigma生產(chǎn);冰醋酸,廣州化學(xué)試劑二廠生產(chǎn)。VEGF、IL-17和IL-23試劑盒,南京建成生物工程研究所提供;MMP-13小鼠單克隆抗體免疫組化S-P試劑盒(北京中山公司),兔抗大鼠MMP-13單克隆抗體、兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體、IP細(xì)胞裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

    3 主要方法

    3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及用藥 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)用大鼠50只,按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法隨機(jī)分為正常對照組10只和CIA模型組40只。模型復(fù)制方法:將雞Ⅱ型膠原15 mg 溶于7.5 mL 預(yù)先配制好的0.1 mol·L-1醋酸中,雞Ⅱ型膠原濃度為2 g·L-1,共7.5 mL,于4 ℃過夜充分溶解。次日,與弗氏完全佐劑等體積于冰浴中混合并使之充分乳化,制成穩(wěn)定的乳化劑15 mL(每mL含1 mgⅡ型膠原,置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。在大鼠的左后肢足跖皮下注射0.1 mL致炎,第7天在大鼠尾、背多點(diǎn)皮下注射0.1 mL該膠原乳劑作為激發(fā)注射。正常對照組在同一部位同樣方法注射0.1 mL生理鹽水。造模后發(fā)現(xiàn)36只大鼠左足紅腫明顯,體積增大,說明造模成功,成功率為90%。將造模成功的36只大鼠隨機(jī)分為模型對照組、地塞米松治療組及 TMP 100 mg·kg-1及 50 mg·kg-1治療組,每組 9只。TMP組大鼠于造模后第7~35天ig給予TMP 100 mg·kg-1和50 mg·kg-1,每天用藥1 次;地塞米松治療組ig給予2 mg·kg-1,每天用藥1次;正常對照組和模型對照組ig給予2 mL·kg-1生理鹽水,每天用藥1次。

    3.2 CIA大鼠體重測定 在致炎前(第0天)及致炎后第7、14、21、28和35天分別測量各組大鼠體重。3.3 血清細(xì)胞因子測定 實(shí)驗(yàn)第36天向CIA大鼠腹腔內(nèi)注射3%巴比妥鈉0.3~0.4 mL麻醉。剪開大鼠腹腔,10 mL注射器心臟取血,室溫靜置1 h,3 000 r/min離心15 min,吸取上層血清。用ELISA測定法(按試劑盒說明書進(jìn)行操作)測定CIA大鼠血清中VEGF、IL-17和IL-23的含量。

    3.4 病理切片 于制模第36天取下大鼠足跖部位的組織,用10%中性緩沖甲醛及時(shí)固定,石蠟包埋,切片,HE染色。

    3.5 MMP-13 蛋白表達(dá)

    3.5.1 免疫組化染色檢測 (1)取大鼠左足跖部位的組織,依次進(jìn)行10%中性緩沖甲醛固定、石蠟包埋、切片、貼片(載玻片預(yù)先用多聚賴氨酸浸泡,撈片后于60℃加熱60 min,以使切片緊密貼附)及常規(guī)脫蠟至水后置 0.1 moL·L-1PBS(pH 7.4)中浸泡 5 min。(2)將切片浸入0.01 moL·L-1(pH 6.0)檸檬酸鹽緩沖液中,于微波爐中加熱至100℃、持續(xù)5 min,反復(fù)2次。室溫自然冷卻后,用0.1 moL·L-1PBS洗滌5 min×2次。(3)滴加封閉液羊血清置室溫20 min,甩去多余的液體。(4)滴加1∶50羊抗MMP-13抗體,陰性對照以PBS代替Ⅰ抗,于4℃孵育過夜,以0.1 moL·L-1PBS洗滌5min×3次。滴加生物素標(biāo)記Ⅱ抗,37℃孵育30 min,PBS沖洗5 min×2次。(5)滴加鏈霉抗生物素-過氧化物酶溶液、室溫孵育10 min,同前述。(6)滴加試劑streptavidin-biotin complex(SABC),于37℃孵育30 min,用PBS沖洗5 min×3次。(7)二氨基聯(lián)苯胺顯色:使用DAB顯色試劑盒,取1 mL蒸餾水,加試劑盒中試劑各1滴,混勻后加至切片。室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,自來水沖洗。(8)滴加蘇木素輕度復(fù)染后,依次進(jìn)行脫水、透明、中性膠封片及顯微鏡觀察。

    3.5.2 結(jié)果判斷 以胞漿中出現(xiàn)淡黃至褐黃色細(xì)顆粒狀著色者為陽性細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下,每只動物隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞,計(jì)算每組的陽性表達(dá)率,同時(shí)記錄染色強(qiáng)度,淡黃色為弱陽性(+),棕黃色為中等陽性(++),棕褐色為強(qiáng)陽性(+++),不著色為陰性(-)。

    3.5.3 Western bloting檢測 取0.1 g大鼠左足跖部位的組織加入1 mL裂解液勻漿,12 000×g離心5 min,取上清液測蛋白濃度。將上清液與6×loading buffer混合后,沸水浴加熱5 min,離心取上清。于4℃凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維膜,用5%脫脂奶粉溶液4℃封閉過夜,加入兔抗大鼠MMP-13抗體(工作濃度1∶1 000)室溫孵育1.5 h,PBS/T 洗膜3 ×10 min,加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(工作濃度1∶5 000)室溫孵育膜1 h,PBS/T洗膜4×15 min。曝光底片,掃描保存為電腦文件,用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件將條帶的灰度值數(shù)字化。以GAPDH作內(nèi)參照,目的條帶與其相比得到相對量。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用SPSS 11.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,進(jìn)行單因素方差分析,方差齊時(shí),各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),方差不齊時(shí),各組間兩兩比較采用Tamhance’s T2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 TMP對CIA大鼠體重的影響

    CIA組大鼠于造模后第7天表現(xiàn)為食欲下降、體重減輕、活動減少、精神倦怠、明顯消瘦,與正常組大鼠相比差異顯著(P<0.01);TMP(100 mg· kg-1)和地塞米松給藥14 d后可有效抑制CIA大鼠體重的減輕,與CIA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而CIA+TMP(50 mg· kg-1)組與模型對照組比較無明顯效果,見表1。

    表1 TMP對CIA大鼠體重的影響Table 1.Effect of TMP on body weight of CIA rats(g.Mean±SD.n=9~10)

    2 TMP對CIA大鼠血清VEGF、IL-17和IL-23含量的影響

    CIA組血清VEGF、IL-17和IL-23的含量均較正常組大幅度上升,分別上升了50.00%、62.22%和82.41%(P <0.01);與 CIA 組比較 CIA+TMP(100 mg·kg-1)組血清 VEGF、IL-17和 IL-23的含量明顯降低,分別降低了 33.33%、27.40%和 33.33%(P <0.01);與CIA組比較,地塞米松組血清VEGF、IL-17和IL-23的含量亦明顯降低,分別降低了30.77%、30.14%和 37.25%(P < 0.01);而 CIA+TMP(50 mg·kg-1)治療組與CIA組比較血清 VEGF、IL-17和IL-23的含量無明顯變化,見表2。

    表2 TMP對各組大鼠血清VEGF、IL-17和IL-23含量的影響Table 2.Effect of TMPon the content of serum VEGF,IL-17 and IL-23 in CIA rats(μg/L.Mean±SD.n=9~10)

    3 TMP對CIA大鼠足爪組織病理改變的影響

    正常組大鼠足爪皮下組織細(xì)胞排列規(guī)則,無炎癥細(xì)胞浸潤及血管新生;CIA組大鼠足爪皮下組織細(xì)胞排列紊亂,有大量炎癥細(xì)胞浸潤,血管增生明顯;TMP(100 mg·kg-1)和地塞米松均能明顯改善CIA大鼠足爪病理改變,皮下組織細(xì)胞排列較規(guī)則,亦明顯抑制炎癥細(xì)胞浸潤及血管增生現(xiàn)象;CIA+TMP(50 mg· kg-1)組大鼠足部皮膚的病理狀況無明顯變化,見圖1。

    Figure 1.Effect of TMP on the histopathological changes of the paw tissues in CIA rats(×400).A:normal group;B:CIA group;C:CIA+dexamethasone group;D:CIA+TMP(50 mg· kg-1)group;E:CIA+TMP(100 mg·kg-1)group.圖1 TMP對CIA大鼠足爪組織病理改變的影響

    4 TMP對 CIA大鼠足爪組織中MMP-13蛋白表達(dá)的影響

    4.1 免疫組化 MMP-13蛋白表達(dá)的陽性部位主要在胞漿中,在高倍鏡下可見胞漿內(nèi)有棕黃色的小顆粒。在正常組胞漿內(nèi)幾乎未見陽性染色區(qū)域;而CIA組胞漿染色呈棕黃色,MMP-13蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性;CIA+TMP(100 mg·kg-1)和地塞米松組胞漿內(nèi)略見棕黃色的小顆粒,與CIA組比較差異顯著(P<0.05);CIA+TMP(50 mg·kg-1)組胞漿內(nèi) MMP-13陽性表達(dá)與CIA組相比無顯著差異,見圖2、表3。

    Figure 2.Effect of TMP on MMP-13 protein expression in the paw tissues of CIA rats(SABC,×400).A:normal group;B:CIA group;C:CIA+dexamethasone group;D:CIA+TMP(50 mg· kg-1)group;E:CIA+TMP(100 mg·kg-1)group.圖2 TMP對CIA大鼠足爪組織中MMP-13表達(dá)的影響

    4.2 Western blotting CIA組大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達(dá)量約為正常組的2倍;與CIA組比較,CIA+TMP(100 mg·kg-1)組 MMP-13表達(dá)降低了31.82%(P < 0.01),而 CIA+TMP(500 mg·kg-1)組MMP-13表達(dá)基本上無變化;經(jīng)地塞米松治療后,MMP-13 表達(dá)降低了30.01%(P <0.01),見圖3。

    表3 各組大鼠足爪組織中MMP-13蛋白陽性表達(dá)率Table 3.Positive rates of MMP-13 expression in the paw tissues of CIA rats detected by immunohistochemistry(%.Mean±SD.n=9~10)

    Figure 3.Effect of TMP on MMP-13 expression in the paw tissues of CIA rats determined by Western blotting assay.A:normal group;B:CIA group;C:CIA+dexamethasone group;D:CIA+TMP(50 mg· kg-1)group;E:CIA+TMP(100 mg·kg-1)group.Mean±SD.n=9~10.#P <0.05 vs normal group;△△P <0.01 vs CIA group.圖3 TMP對CIA大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達(dá)的影響

    討 論

    本實(shí)驗(yàn)用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)CIA大鼠模型,模型對照組大鼠逐漸出現(xiàn)食欲下降、體重減輕、活動減少、精神倦怠、明顯消瘦等現(xiàn)象;TMP(50 mg·kg-1)治療組用藥后,CIA大鼠一般狀況與模型對照組比較無明顯減輕,而TMP(100 mg·kg-1)劑量能明顯提高CIA大鼠食欲,增加CIA大鼠活動量,抑制CIA大鼠消瘦,增加其體重,改善CIA大鼠的精神狀況,表明TMP(100 mg·kg-1)對CIA有一定的治療效果。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步探討了TMP治療RA的可能機(jī)制。TMP是中藥川芎的有效成分之一,屬酰胺類生物堿,化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪,有抗腫瘤血管生成、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、抗血小板聚集和抗炎等作用,目前已廣泛應(yīng)用于臨床,是現(xiàn)代中西醫(yī)治療RA的常用藥,但其作用機(jī)制尚不十分明確。

    RA主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、滑膜血管翳形成,關(guān)節(jié)軟骨破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失。關(guān)節(jié)局部炎癥細(xì)胞的浸潤及其分泌的炎癥因子、酶等在RA關(guān)節(jié)炎性破壞中發(fā)揮重要作用[4]。

    成纖維樣滑膜細(xì)胞過度增殖以及滑膜血管新生是RA滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞的最主要原因[5]。VEGF是促進(jìn)血管形成最重要的細(xì)胞因子,不僅促進(jìn)了RA滑膜血管翳形成,而且也是RA發(fā)病過程中的直接促炎因子。Nagashima等[6]發(fā)現(xiàn),VEGF在巨噬樣滑膜襯里細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)。IL-23是新近發(fā)現(xiàn)的一種異源二聚體細(xì)胞因子,近期研究發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織中IL-23 p19 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高[7]。自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,參與一些自身免疫性疾病的發(fā)生,其表面有IL-23受體[8]。IL-23通過結(jié)合NK細(xì)胞膜表面IL-23受體復(fù)合物,通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(如JAK2、STAT3)誘導(dǎo)細(xì)胞激活[8],活化的NK細(xì)胞可合成和分泌多種細(xì)胞因子,如TNF-α、TNF-β等,也可直接刺激 CD4+T細(xì)胞激活分泌IL-17等。IL-17是由促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一種強(qiáng)大的前炎癥細(xì)胞因子,也是炎癥反應(yīng)的微調(diào)因子,可以刺激成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、上皮及內(nèi)皮細(xì)胞釋放 IL-6、IL-8、前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)、基質(zhì)金屬蛋白酶、單核細(xì)胞化學(xué)趨化蛋白和粒細(xì)胞集落刺激因子等細(xì)胞因子。IL-17還可誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子1,促進(jìn)T細(xì)胞增殖。IL-17能夠與多種細(xì)胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用,以放大炎癥反應(yīng)。在RA發(fā)病過程中,IL-17不僅可誘發(fā)人滑膜細(xì)胞產(chǎn)生GM-CSF和PGE2[9],還可以通過PI3K途徑激活NF-κB,進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞釋放大量炎癥因子IL-6和IL-8[10],誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分泌VEGF、肝細(xì)胞生長因子等多種促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子。我們的研究證實(shí),TMP(100 mg· kg-1)可明顯降低CIA大鼠血清中VEGF、IL-17和IL-23的含量。基質(zhì)金屬蛋白酶幾乎能降解所有細(xì)胞外基質(zhì)成分,還可激活其它基質(zhì)金屬蛋白酶,形成瀑布效應(yīng)。MMP-13是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種,又名間質(zhì)膠原酶,可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ及Ⅺ型膠原纖維,而這些成分也是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分,在 RA 發(fā)病中起著重要作用[11]。同時(shí),Kim 等[12]研究證實(shí)MMP-13在RA關(guān)節(jié)骨及軟骨的破壞中發(fā)揮重要作用。而我們的實(shí)驗(yàn)同樣證明,TMP(100 mg·kg-1)可明顯下調(diào)CIA大鼠足爪皮下組織中MMP-13蛋白的表達(dá),抑制CIA大鼠足爪皮下組織炎癥細(xì)胞浸潤劑血管增生。本研究中地塞米松與TMP(100 mg· kg-1)對CIA大鼠的治療效果都比較理想,但地塞米松為糖皮質(zhì)激素類藥物,長期使用易導(dǎo)致患者對激素的依賴性,食欲亢進(jìn),體重增加,面部及頸背部皮下脂肪增厚,胃及十二指腸潰瘍,胃腸出血,繼發(fā)感染、高血壓、糖尿病、肌肉無力、骨質(zhì)疏松等全身的不良反應(yīng)。而TMP藥物毒性低,避免了諸多藥物副作用。

    猜你喜歡
    血清
    血清免疫球蛋白測定的臨床意義
    中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:50:04
    Meigs綜合征伴血清CA-125水平升高1例
    慢性腎臟病患者血清HIF-1α的表達(dá)及臨床意義
    慢性鼻-鼻竇炎患者血清IgE、IL-5及HMGB1的表達(dá)及其臨床意義
    血清H-FABP、PAF及IMA在冠心病患者中的表達(dá)及其臨床意義
    血清IL-6、APC、CRP在膿毒癥患者中的表達(dá)及臨床意義
    血清HBV前基因組RNA的研究進(jìn)展
    血清馴化在豬藍(lán)耳病防控中的應(yīng)用
    LC-MS/MS法同時(shí)測定養(yǎng)血清腦顆粒中14種成分
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:47
    血清胱抑素C與小動脈閉塞型卒中的關(guān)系
    一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美区成人在线视频| 美女免费视频网站| 日本免费a在线| bbb黄色大片| 精品久久久久久久久久久久久| 特级一级黄色大片| 午夜福利18| 成人特级av手机在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 91在线观看av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲性夜色夜夜综合| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品电影一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 五月玫瑰六月丁香| av女优亚洲男人天堂| 国产色爽女视频免费观看| 在线观看66精品国产| avwww免费| 日本爱情动作片www.在线观看 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 不卡一级毛片| 五月玫瑰六月丁香| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品国内亚洲2022精品成人| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国模一区二区三区四区视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产高潮美女av| 亚洲av成人av| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产探花在线观看一区二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲性夜色夜夜综合| 很黄的视频免费| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 成人午夜高清在线视频| 国产精品一区www在线观看 | 深爱激情五月婷婷| 国产中年淑女户外野战色| av专区在线播放| 国产高潮美女av| 有码 亚洲区| 国产淫片久久久久久久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 免费观看在线日韩| 国产高清视频在线观看网站| 一级黄片播放器| 欧美高清成人免费视频www| 欧美日韩黄片免| 亚洲自偷自拍三级| 国产美女午夜福利| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品精品国产色婷婷| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美高清成人免费视频www| 午夜福利在线在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 特大巨黑吊av在线直播| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲av免费高清在线观看| 国内精品久久久久精免费| 人妻夜夜爽99麻豆av| 色吧在线观看| av在线天堂中文字幕| 免费观看的影片在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| a级一级毛片免费在线观看| 中文资源天堂在线| 久久精品国产亚洲网站| 久久久久久久久久久丰满 | 久久草成人影院| 校园春色视频在线观看| 亚洲性久久影院| av天堂中文字幕网| 全区人妻精品视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产亚洲精品av在线| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲av免费在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久精品国产亚洲av天美| 国内精品一区二区在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 精品久久国产蜜桃| 桃红色精品国产亚洲av| 天堂影院成人在线观看| 少妇高潮的动态图| 精品久久久久久,| 亚洲精品国产成人久久av| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | x7x7x7水蜜桃| 免费在线观看日本一区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲av免费在线观看| 日本a在线网址| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 午夜日韩欧美国产| 熟女电影av网| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人综合一区亚洲| 黄色一级大片看看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美精品国产亚洲| 嫩草影院入口| 国内精品宾馆在线| 亚洲精品456在线播放app | 美女黄网站色视频| 超碰av人人做人人爽久久| 久9热在线精品视频| 国产av一区在线观看免费| 欧美日本视频| 精品一区二区三区人妻视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲四区av| 在线播放国产精品三级| 欧美不卡视频在线免费观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 97超视频在线观看视频| 久久草成人影院| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲av成人av| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品三级大全| 亚洲不卡免费看| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品三级大全| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 色哟哟哟哟哟哟| 国产一区二区激情短视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲av二区三区四区| 日韩欧美三级三区| 成人二区视频| 成人av一区二区三区在线看| 搡老妇女老女人老熟妇| 黄色欧美视频在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 美女cb高潮喷水在线观看| 赤兔流量卡办理| 色播亚洲综合网| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99久久精品国产国产毛片| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av免费在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久久国产成人精品二区| 欧美区成人在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 免费看日本二区| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲精品国产成人久久av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品一区二区三区四区久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产高清不卡午夜福利| 91久久精品国产一区二区三区| 老司机福利观看| 1000部很黄的大片| 岛国在线免费视频观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 少妇被粗大猛烈的视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲无线观看免费| 日日撸夜夜添| 成人亚洲精品av一区二区| 色哟哟哟哟哟哟| 嫩草影院新地址| 国产色爽女视频免费观看| 国产三级在线视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲男人的天堂狠狠| 一区二区三区高清视频在线| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩一区二区视频免费看| 黄片wwwwww| 精品欧美国产一区二区三| av在线亚洲专区| 色吧在线观看| 91精品国产九色| 我的老师免费观看完整版| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人综合一区亚洲| 高清日韩中文字幕在线| 老司机福利观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲国产精品sss在线观看| 成年人黄色毛片网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久久久久大精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 色在线成人网| 精品欧美国产一区二区三| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 深爱激情五月婷婷| 黄色欧美视频在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 老司机福利观看| 日韩人妻高清精品专区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产亚洲精品av在线| 精品乱码久久久久久99久播| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美日韩黄片免| 99国产精品一区二区蜜桃av| 中文资源天堂在线| 丰满乱子伦码专区| 免费观看精品视频网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 婷婷丁香在线五月| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲精华国产精华精| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 在线观看免费视频日本深夜| 波多野结衣高清作品| 亚洲人与动物交配视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 88av欧美| 成年免费大片在线观看| av福利片在线观看| 波多野结衣高清作品| 99热6这里只有精品| 久久久久久久久久成人| 精品久久久久久久久亚洲 | 国产乱人伦免费视频| 免费电影在线观看免费观看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 日韩人妻高清精品专区| 淫秽高清视频在线观看| 日本黄色片子视频| 日本熟妇午夜| 草草在线视频免费看| 免费搜索国产男女视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| av在线蜜桃| 久久久久久久午夜电影| 99热这里只有是精品在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 成人午夜高清在线视频| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品人妻1区二区| 日韩欧美免费精品| 日本在线视频免费播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产成人aa在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 日本与韩国留学比较| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久人妻av系列| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜亚洲福利在线播放| 99久久成人亚洲精品观看| ponron亚洲| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 别揉我奶头 嗯啊视频| 天堂网av新在线| 国产三级中文精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 老司机福利观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久久久伊人网av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日韩欧美国产在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲av熟女| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜影院日韩av| 成人无遮挡网站| 少妇的逼水好多| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜精品在线福利| 欧美日本视频| 久久精品国产清高在天天线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产免费av片在线观看野外av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品国内亚洲2022精品成人| 少妇的逼好多水| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品国产清高在天天线| 真实男女啪啪啪动态图| 88av欧美| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 九色国产91popny在线| 亚洲美女视频黄频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 伊人久久精品亚洲午夜| 中文资源天堂在线| 国产精品无大码| 男女视频在线观看网站免费| 日韩 亚洲 欧美在线| 可以在线观看毛片的网站| 精品人妻视频免费看| 中国美女看黄片| 成人欧美大片| 成人三级黄色视频| 日本欧美国产在线视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品一及| aaaaa片日本免费| 精品福利观看| 九色成人免费人妻av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲avbb在线观看| av在线蜜桃| a级一级毛片免费在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 久99久视频精品免费| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美色视频一区免费| 女同久久另类99精品国产91| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 小说图片视频综合网站| 亚洲四区av| 日本-黄色视频高清免费观看| 性色avwww在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲最大成人手机在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 好男人在线观看高清免费视频| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲人与动物交配视频| 午夜影院日韩av| 免费看av在线观看网站| 日本色播在线视频| 日韩欧美在线二视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 别揉我奶头 嗯啊视频| www.色视频.com| 高清在线国产一区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费观看精品视频网站| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 免费看日本二区| 五月伊人婷婷丁香| 国产av一区在线观看免费| 免费av毛片视频| av黄色大香蕉| 国产高清视频在线观看网站| 麻豆一二三区av精品| 淫秽高清视频在线观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产视频一区二区在线看| 男插女下体视频免费在线播放| 999久久久精品免费观看国产| 久久久国产成人免费| 22中文网久久字幕| aaaaa片日本免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 人妻久久中文字幕网| 日本 av在线| av黄色大香蕉| 床上黄色一级片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 91久久精品国产一区二区三区| 男人舔奶头视频| 久久九九热精品免费| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲精品一区av在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 校园春色视频在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国内精品久久久久精免费| 亚洲国产欧美人成| 国产精品99久久久久久久久| 夜夜爽天天搞| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 乱码一卡2卡4卡精品| 免费高清视频大片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产极品精品免费视频能看的| 人妻少妇偷人精品九色| 国产三级在线视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久精品国产清高在天天线| av专区在线播放| av在线天堂中文字幕| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 中国美女看黄片| 国产精品一区二区性色av| 午夜激情欧美在线| 午夜福利欧美成人| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费搜索国产男女视频| 内射极品少妇av片p| 嫩草影院入口| 悠悠久久av| aaaaa片日本免费| 3wmmmm亚洲av在线观看| 男女那种视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 亚洲国产精品合色在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩一本色道免费dvd| 成人二区视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美最黄视频在线播放免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 一个人看的www免费观看视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美丝袜亚洲另类 | 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美性感艳星| 欧美最新免费一区二区三区| 国产真实乱freesex| 免费人成视频x8x8入口观看| 在线天堂最新版资源| av女优亚洲男人天堂| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产伦精品一区二区三区四那| 日本免费a在线| 国产老妇女一区| 熟女人妻精品中文字幕| 91av网一区二区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品三级大全| 黄色配什么色好看| 好男人在线观看高清免费视频| 免费看a级黄色片| 日本三级黄在线观看| 长腿黑丝高跟| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 禁无遮挡网站| 村上凉子中文字幕在线| 老女人水多毛片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产毛片a区久久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 久久人人精品亚洲av| 又爽又黄a免费视频| 天堂动漫精品| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 国产伦在线观看视频一区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产v大片淫在线免费观看| 色吧在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲 国产 在线| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美精品国产亚洲| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜精品在线福利| 日本色播在线视频| 亚洲在线观看片| 免费看美女性在线毛片视频| 全区人妻精品视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 在线国产一区二区在线| 色播亚洲综合网| 欧美一区二区精品小视频在线| 老司机福利观看| 天堂√8在线中文| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲乱码一区二区免费版| 又爽又黄a免费视频| 综合色av麻豆| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 最新中文字幕久久久久| 国产精品电影一区二区三区| 欧美zozozo另类| 悠悠久久av| 老司机福利观看| 哪里可以看免费的av片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 最近在线观看免费完整版| 成人三级黄色视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产一级毛片七仙女欲春2| 成人二区视频| 亚洲av成人av| 国产精品国产高清国产av| 成人av在线播放网站| avwww免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品久久久久久av不卡| 男人舔奶头视频| 天堂影院成人在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产亚洲欧美98| 亚洲av美国av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产人妻一区二区三区在| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 毛片一级片免费看久久久久 | 日韩亚洲欧美综合| 欧美bdsm另类| 少妇的逼水好多| www.www免费av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成年免费大片在线观看| eeuss影院久久| 一本精品99久久精品77| 亚洲av成人av| 亚洲成av人片在线播放无| av视频在线观看入口| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 免费观看的影片在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 免费在线观看成人毛片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美bdsm另类| 国产综合懂色| 有码 亚洲区| 伦精品一区二区三区| 69人妻影院| 又紧又爽又黄一区二区| 1024手机看黄色片| 欧美最新免费一区二区三区| 精品国产三级普通话版| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品一区二区性色av| 无人区码免费观看不卡| 男女下面进入的视频免费午夜| 真实男女啪啪啪动态图| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产精品永久免费网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲国产欧美人成| 国产成人一区二区在线| 亚洲七黄色美女视频| 999久久久精品免费观看国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲美女视频黄频| av专区在线播放| 听说在线观看完整版免费高清| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 色5月婷婷丁香| 成人午夜高清在线视频| 免费在线观看影片大全网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久精品国产清高在天天线| 在线国产一区二区在线| 男女视频在线观看网站免费| 1000部很黄的大片| 免费看日本二区| 精品一区二区免费观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲国产精品成人综合色| 久久精品91蜜桃| 亚洲成人久久爱视频| 无遮挡黄片免费观看| 色av中文字幕| 99热只有精品国产| 波多野结衣巨乳人妻|