以豬角膜脫細胞基質(zhì)為載體培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞構(gòu)建實驗性角膜后板層*

祁 冰， 侯光輝△， 李 柳， 季青山， 吳 靜， 周 清

(1暨南大學(xué)附屬第三醫(yī)院，珠海市人民醫(yī)院眼科，廣東珠海519000;2南昌大學(xué)附屬第三醫(yī)院，南昌市第一醫(yī)院眼科，江西南昌330038;3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，廣東廣州510630;4暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科研究室，廣東廣州510632)

角膜盲是我國主要致盲性眼病之一。據(jù)2006年第2次全國殘疾人抽樣調(diào)查統(tǒng)計顯示，因角膜病致盲患者約400萬人［1］。角膜移植是治療角膜盲的重要手段之一，但因材料供不應(yīng)求且角膜內(nèi)皮損傷后不可再生修復(fù)等因素限制了其在臨床的應(yīng)用。我國早在2002年就已建立深低溫保存活性角膜技術(shù)使角膜內(nèi)皮細胞活性達92.6%，保存期也可長達一年以上［2］。但由于社會、文化和宗教等原因，我國的角膜供體資源仍極其短缺，因此人們開始嘗試尋找更多有利于代替角膜內(nèi)皮細胞的種子細胞及其體外培養(yǎng)的生物載體［3-6］，用以構(gòu)建組織工程角膜。本實驗以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為種子細胞，在冷凍脫水保存的豬角膜后彈力膜/基質(zhì)載體上進行體外誘導(dǎo)，觀察其向角膜內(nèi)皮樣細胞分化的潛能，并嘗試利用構(gòu)建的組織工程角膜進行兔的角膜后板層移植。

材料和方法

1 種子細胞的來源及分離培養(yǎng)

人臍帶取自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科。無菌狀態(tài)下剪取健康新生兒臍帶，長度＞20 cm，立即放入滅菌的PBS緩沖液中，4℃保存，2 h內(nèi)進行分離。超凈臺內(nèi)剪除破損部分，找到臍靜脈口，插入去掉針尖的16號注射針頭，用止血鉗夾住，PBS沖洗臍靜脈腔至無血跡。從針頭向靜脈內(nèi)灌注0.1%I型膠原酶，待液體從另一端流出后，止血鉗夾閉此端，使靜脈完全充盈。將臍帶放入盛有約300 mL PBS的燒杯中，置37℃的水浴中約12 min。消化后取出臍帶。輕柔按摩血管以增加內(nèi)皮細胞脫落，打開一端止血鉗收集消化液于燒杯中，用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)沖洗臍靜脈2次，將沖洗液收集后置于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，向沉淀中加入含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打制成均勻的細胞懸液，接種于25 mL的培養(yǎng)瓶，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后換液，以后每2 d換液1次。待原代細胞培養(yǎng)至80%以上融合時，傾去培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2遍，然后加入0.25%胰蛋白酶，常溫下消化2 min，當見細胞出現(xiàn)皺縮，細胞間隙增大時，加入含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液終止消化。將細胞懸液收集于離心管中，1 000 r/min離心5 min后，1∶2比例接種于新的培養(yǎng)瓶中［7-9］。

2 載體的制備與保存

取新鮮豬眼球，生理鹽水反復(fù)沖洗，剪去球周組織，浸泡于含慶大霉素(4×105U/L)的PBS緩沖液中，置4℃冰箱30 min，再用含青霉素、鏈霉素(各2×105U/L)的PBS沖洗3次。無菌紗布包裹眼球，僅暴露角膜部分，眼科穿刺刀斜行向上進入眼球做微型切口;無菌虹膜恢復(fù)器從切口處沿角膜緣完整分離板層角膜基質(zhì)后，眼科剪沿角膜緣處剪除角膜上皮層和前彈力層組織，再用穿刺刀平行進入眼球，沿角膜緣內(nèi)1 mm處剪下剩余角膜板層(包括基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層)，將角膜基質(zhì)深板層內(nèi)皮面朝上置于無菌培養(yǎng)皿中-80℃凍存3 d。解凍后加入1.2×103U/L中性蛋白酶II 37℃孵育5 min，體視顯微鏡下用細胞刮子刮除內(nèi)皮細胞，并在倒置顯微鏡下觀察，確保角膜內(nèi)皮細胞去除干凈。余下的角膜組織(約占豬角膜厚度的1/4～1/3)放入PBS液中沖洗2～3次，置純甘油中4℃脫細胞48 h。經(jīng)上述處理的角膜組織后彈力層面朝上，用6.2 mm環(huán)鉆鉆穿后取下，于純甘油中4℃密封保存6個月［10］。接種細胞前進行水、紫外線兩面滅菌各30 min，平鋪置96孔培養(yǎng)板，角膜后彈力面朝上，接種血管內(nèi)皮細胞［11］。

3 HUVECs的CM-DiI標記及移植片的接種

培養(yǎng)的第2代HUVECs貼壁融合達80%時加入含4 mg/L CM-DiI的培養(yǎng)基，37℃孵育30 min，PBS洗2遍后，熒光顯微鏡下觀察細胞標記情況并拍照，然后消化細胞傳代培養(yǎng)。將標記的2～3代血管內(nèi)皮細胞胰酶消化后，用含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為每孔1×105，吹打均勻，接種于96孔培養(yǎng)板中附有預(yù)處理過的角膜組織片上［12］，液體量每孔約200μL，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，避免搬動。3 d后首次換液，以后每2 d換液1次，培養(yǎng)1周至細胞形成集落后，部分固定行形態(tài)學(xué)觀察及密度測定，組織切片掃描電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)，另一部分行角膜深板層移植。

4 角膜深板層移植

24只正常健康新西蘭大白兔按照隨機處理原則分成實驗組和對照組各12只，均設(shè)左眼為實驗眼。角膜移植術(shù)前以3%戊巴比妥鈉給家兔行全身麻醉，耳緣靜脈進針，用量為1～1.5 mL/kg。0.4%奧布卡因滴眼液結(jié)膜囊表面麻醉，含慶大霉素的PBS緩沖液沖洗眼球，消毒鋪巾，開瞼器開瞼。固定眼球后，參考Fernandez等［13］的方法進行角膜后板層移植，角膜中央以角膜環(huán)鉆切除約7.5 mm、1/4厚角膜上皮板層，待用。角膜中央再以角膜環(huán)鉆切除約6.2 mm余下全層角膜，實驗組移植種植有HUVECs的豬角膜基質(zhì)深板層，且將負載有血管內(nèi)皮細胞的板層面朝下。對照組移植單純豬角膜基質(zhì)深板層片(未種植血管內(nèi)皮細胞的基質(zhì)板層)。10-0尼龍縫線連續(xù)環(huán)形縫合12～16針。術(shù)后，2組實驗兔均每天用四環(huán)素可的松眼膏點眼，觀察移植眼角膜透明度。

5 掃描電鏡觀察

用PBS緩沖液沖洗干凈實驗組與對照組豬角膜基質(zhì)板層片后將其浸泡在裝有2.5%戊二醛培養(yǎng)瓶中，置4℃冰箱中過夜。次日用PBS液沖洗3遍，分別以50%、70%、80%和90%梯度逐級遞增的乙醇進行脫水處理，各濃度中都需浸泡10 min，最后放入100%乙醇中脫水3次，中間更換新的乙醇，每次10 min。脫水后轉(zhuǎn)入中間液(醋酸異戊酯)中以便將其中的乙醇置換出來，時間約15～30 min，操作中間需更換1次新的中間液，共2次，然后臨界點干燥法行干燥處理，繼而貼銅臺，掃描電鏡觀察細胞表面結(jié)構(gòu)，并拍照記錄。

6 取材固定

移植8周后空氣栓塞法處死實驗兔，剜除實驗眼，浸泡于含慶大霉素(4×105U/L)的PBS溶液中，置4℃冰箱30 min。超凈臺內(nèi)剪下角膜組織，PBS緩沖液沖洗干凈，角膜組織標本用OCT(optimal cutting temperature)包埋劑封固，行冰凍切片處理。

7 免疫熒光染色檢測角膜內(nèi)皮細胞抗原標志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和緊密連接蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)

上述制成的切片用冷丙酮室溫固定10 min后用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。切片組織覆蓋處滴加驢血清，置室溫中30 min，PBS沖洗3次，每次3 min。接著滴加1∶100的山羊抗人NSE單克隆抗體，4℃冰箱中過夜，次日PBS沖洗3次，每次3 min。再以1∶50的驢抗山羊Ⅱ抗滴加，37℃避光孵育30 min，同樣用PBS沖洗3次，3 min/次后避光保存，盡快行熒光顯微鏡下拍照記錄。ZO-1檢測也需將制備好的切片組織以上述方法滴加1∶100的小鼠抗人ZO-1單克隆抗體，4℃冰箱中過夜，避光孵育30 min，同樣用PBS沖洗3次，每次3 min，避光保存，拍照記錄。

結(jié) 果

1 HUVECs的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察可見，早期細胞呈小多角形、球形、呈團狀，少數(shù)細胞伸展，24 h后可見細胞貼壁，逐漸生長呈短梭狀或鵝卵石樣鑲嵌排列，見圖1A。臍靜脈內(nèi)皮細胞胞膜完整，胞核清晰，呈圓形或橢圓形，核分裂相多見，1～2個核仁，胞漿豐富，3～4 d后融合，呈多角形，為單層呈鋪路石狀排列，見圖1B。

Figure 1.Morphology of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)observed under inverted microscope(A:×100;B:×200).圖1 鏡下人臍靜脈內(nèi)皮細胞的形態(tài)特征

2 原代HUVECs的生長曲線

每次經(jīng)胰蛋白酶消化而獲得的血管內(nèi)皮細胞，活細胞百分率＞95%。接種后24 h內(nèi)細胞貼壁率為80%，以后細胞以對數(shù)形式增殖，倍增時間為2.5 d，見圖2。

Figure 2.The growth curve of HUVECs determined by MTT assay.圖2 MTT法繪制HUVECs生長曲線

3 HUVECs CM-DiI標記后的細胞形態(tài)及傳代后的熒光表達情況

CM-DiI標記HUVECs，標記率達90%以上，染色后的細胞呈現(xiàn)紅色環(huán)狀的熒光顆粒，形態(tài)表現(xiàn)為短梭形、橢圓形，同未染色的細胞形態(tài)大致相同，而中間未染色區(qū)域為細胞核，見圖3A。細胞傳3代時紅色熒光表達仍很強，但較前相對減弱，見圖3B。

4 豬角膜深板層的處理情況

經(jīng)甘油處理后的豬角膜基質(zhì)深板層在倒置顯微鏡下可見其表面光整，無內(nèi)皮細胞殘留，見圖4A。在光鏡下同樣可見，處理后的角膜基質(zhì)深板層僅保留了支架的完整網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖4B。掃描電鏡顯示去除內(nèi)皮細胞的豬角膜基質(zhì)深板層面光滑平坦，未見有細胞生長，見圖4C。

Figure 3.HUVECs labeled with CM-DiI(×100).A:under fluorescence microscope，red granular particles were CMDiI-labeled HUVECs;B:passage tracing of HUVECs by CM-DiI labeling.圖3 CM-DiI標記的人臍靜脈內(nèi)皮細胞

Figure 4.Preparation of porcine corneal posterior lamellae.A:under inverted microscope，porcine corneal posterior lamellae were treated with 100%glycerinum(×50);B:light microscopy showed porcine corneal posterior lamellae did not have endothelial cell residue，only the complete mesh structure was observed(×100);C:as shown by electron microscopy，the surface of porcine corneal posterior lamellae was smooth and flat(×2 500).圖4 豬角膜基質(zhì)深板層的處理情況

5 種植在豬角膜基質(zhì)深板層上HUVECs的生長情況

鏡下觀察顯示，種植在豬角膜基質(zhì)深板層上的HUVECs經(jīng)培養(yǎng)7 d后，細胞間緊密連接相互融合呈鋪路石狀并逐漸與板層組織相互貼合形成單層，見圖5A。電鏡下，實驗組種植有HUVECs的豬角膜基質(zhì)深板層表面細胞呈圓形或多角形，連接成片，表面有微絨毛，富有立體感，見圖5B。

Figure 5.Growth of HUVECs seeded on porcine cornea acellular matrix.A:as shown by inverted microscopy，the HUVECs formed a monolayer on the Descemet's membrane of dehydrated porcine corneal stroma(×100);B:by electron microscopy，microvilli were observed on the surface of cells and the nuclei were clear to see(×2 500).圖5 種植在豬角膜基質(zhì)載體上的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的生長情況

6 豬角膜基質(zhì)深板層移植術(shù)及術(shù)后兔角膜透明度的觀察

手術(shù)顯微鏡下為新西蘭大白兔行豬角膜基質(zhì)深板層移植，見圖6，并于術(shù)后每天為其實驗眼涂抹抗生素眼膏，術(shù)后8周觀察可見，豬角膜基質(zhì)深板層面種植有HUVECs的實驗組，其角膜基本透明，周邊角膜略有水腫，角膜的透光率和吸光度與未手術(shù)角膜比較無顯著差異，見圖7A。而未載有血管內(nèi)皮細胞的單純豬角膜深板層移植術(shù)后，角膜明顯水腫，混濁，并逐漸形成潰瘍，見圖7B。

Figure 6.HUVECs were seeded onto Descemet's membrane and cultured in vitro for 7～10 d，and then were used for transplantation.圖6 顯微鏡下行豬角膜基質(zhì)深板層移植

Figure 7.Observation of rabbit corneal transparency after lamellar keratoplasty.A:experimental group;B:control group.圖7 板層角膜移植術(shù)后兔角膜透明度的觀察

7 移植術(shù)后角膜板層組織免疫熒光染色

移植術(shù)8周后空氣栓塞法處死實驗兔，取出實驗眼角膜板層組織行免疫熒光染色，鏡下觀察可見實驗組豬角膜基質(zhì)深板層上的HUVECs表達角膜內(nèi)皮相對特異性蛋白NSE，并發(fā)綠色熒光，見圖8A，將其同一視野內(nèi)細胞核以DAPI復(fù)染后，發(fā)藍色熒光，見圖8B。實驗組豬角膜基質(zhì)深板層上的HUVECs經(jīng)ZO-1染色結(jié)果同樣表現(xiàn)為陽性，發(fā)綠色熒光，見圖9A，對同一視野內(nèi)細胞核行DAPI復(fù)染后，發(fā)藍色熒光，見圖9B。

Figure 8.NSE expression examined by immunofluorescent staining in porcine corneal posterior lamellae from experimental group(×200).A:HUVECs expressed NSE(green fluorescence);B:in the same visual field，the nuclei showed blue fluorescence by DAPI counterstaining.圖8 實驗組豬角膜基質(zhì)后彈力層面上NSE的表達

Figure 9.ZO-1 expression examined by immunofluorescent staining in porcine corneal posterior lamellae from experimental group(×200).A:HUVECs expressed ZO-1(green fluorescence);B:in the same visual field，the nuclei showed blue fluorescence by DAPI counterstaining.圖9 實驗組豬角膜基質(zhì)后彈力層面上ZO-1的表達

討 論

本研究選用的異種生物載體［14］為除去上皮和內(nèi)皮層的豬角膜基質(zhì)深板層，是一種低免疫原性生物載體材料，含有豐富的細胞外基質(zhì)成分(包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖)、其間散布有角膜基質(zhì)細胞和極少數(shù)游走的白細胞，這與人類角膜的結(jié)構(gòu)類似。張米等［15］將自體脂肪干細胞體外種植在豬角膜基質(zhì)上并行板層角膜移植治療堿燒傷，術(shù)后角膜基本恢復(fù)透明，未發(fā)生排斥反應(yīng)。邵春益等［16］以豬角膜脫細胞基質(zhì)為載體培養(yǎng)貓骨髓內(nèi)皮祖細胞，所獲得的貓骨髓內(nèi)皮祖細胞可在豬角膜脫細胞基質(zhì)上單層生長，黏附較好，形態(tài)上呈多邊形，至少可維持1個月。因此相比上皮層和內(nèi)皮層，基質(zhì)層的成分復(fù)雜但免疫原性低［17］，可作為種子細胞的理想載體，且該載體與人角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，具有良好的屈光作用，來源廣泛、細胞自然生長環(huán)境、具有一定形狀與厚度、便于移植等優(yōu)點。

進行組織工程選用的種子細胞應(yīng)當具有容易獲得、能夠長期維持其生理功能和生物活性、抗原性小等特性［18-19］。從上世紀70年代起學(xué)者們就開始尋求治療角膜內(nèi)皮損傷的新材料和新方法，并曾嘗試利用正常的異體角膜內(nèi)皮細胞進行替代移植。但因人體角膜內(nèi)皮細胞在體內(nèi)并不具增殖性，而且在體外增殖也有限，因此其應(yīng)用受到很大的限制。Gospodarowicz等［20］認為血管內(nèi)皮細胞和角膜內(nèi)皮細胞存在許多相似之處，故應(yīng)用這2種細胞進行相關(guān)的聯(lián)合移植實驗，獲得了一定的成功。吳小莉等［21］和羅哲文等［22］用人臍靜脈內(nèi)皮細胞種植在處理過的羊膜上，待形成單層后用于貓眼角膜內(nèi)皮細胞移植，植片在1周內(nèi)保持完全透明，說明該細胞可行使角膜內(nèi)皮細胞的屏障及液泵功能。

種子細胞的移植示蹤是確定移植是否成功的重要依據(jù)。目前通過細胞移植示蹤研究其能否在受損器官上定植，方法有多種。本實驗采用一種較新的細胞膜熒光染料CM-DiI(氯苯甲酰氨-1，1’-雙十八烷基-3，3'，3'，3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽)標記HUVECs，并在體外傳代培養(yǎng)，觀察它的標記情況。由于它是一種親脂性的碳花青熒光膜染料，容易嵌進生物質(zhì)膜內(nèi)并在膜內(nèi)做定向擴散運動從而可有效地標記整個細胞，是目前最好的熒光染料。它的熒光激發(fā)波長為553 nm，發(fā)射波長為570 nm，在綠色光激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。有研究表明，低濃度CMDil標記細胞無毒性，細胞免疫表型或分化狀態(tài)等改變均不影響細胞標記，標記后的細胞生物學(xué)特性包括增殖、遷移、分化能力、旁分泌作用等均無改變，而且不出現(xiàn)細胞間傳遞的現(xiàn)象［23-24］。

角膜內(nèi)皮細胞是附著在后彈力層面上的單層六角形扁平細胞。本課題組所設(shè)計的異種生物載體［25］，是內(nèi)皮細胞的自然生長環(huán)境，以CM-DiI標記的HUVECs為種子細胞構(gòu)建角膜后板層，可見到細胞在載體上生長良好，并由短梭狀、鵝卵石樣排列逐漸融合，最后緊密連接形成單層。

本實驗移植術(shù)后的角膜在位，未發(fā)生排斥反應(yīng)，說明豬角膜基質(zhì)深板層片在兔角膜上移植能存活。并觀察實驗組和對照組新西蘭大白兔的術(shù)眼角膜透明度，可明顯看到種植有血管內(nèi)皮細胞的豬角膜基質(zhì)深板層實驗組，術(shù)眼角膜基本透明，而對照組，單純豬角膜板層移植的術(shù)眼角膜仍然水腫混濁，說明HUVECs已經(jīng)部分向角膜內(nèi)皮方向轉(zhuǎn)化，同時已具有一定的角膜內(nèi)皮泵水功能［26］，并在一定程度上改善了損傷兔角膜的眼表形態(tài)［27］。B?hnke 等［28］報道，用抗人的NSE單克隆抗體對人眼組織進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細胞染色結(jié)果陽性，而人基質(zhì)細胞筋膜囊成纖維細胞和角膜上皮均不能被染色，證明其是眼范圍內(nèi)內(nèi)皮細胞所特有的。Zhu等［29］用抗體ZO-1免疫染色顯示出了角膜內(nèi)皮細胞的規(guī)則多邊形結(jié)構(gòu)。因此NSE和ZO-1均是角膜內(nèi)皮相對特異性蛋白，對實驗組種植后的血管內(nèi)皮細胞行 NSE及ZO-1染色，其結(jié)果均為陽性，也同樣證明了豬角膜基質(zhì)深板層的微環(huán)境用以誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細胞向角膜內(nèi)皮細胞方向轉(zhuǎn)化的可行性。