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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測生地黃治療銀屑病的分子機(jī)制*

    2013-12-01 08:52:12姜春燕張廣中李元文韓學(xué)杰呂愛平
    關(guān)鍵詞:靶標(biāo)藥理學(xué)銀屑病

    姜春燕,譚 勇,呂 誠,李 立,李 健,張廣中,李元文,姜 淼,韓學(xué)杰,呂愛平△

    (1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科,北京 100010;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100700;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體形態(tài)學(xué)系,北京 100029;4.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東方醫(yī)院皮膚科,北京 100078)

    銀屑病俗稱牛皮癬,中醫(yī)古稱白疕,是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病,屬于皮外科的疑難雜癥之一。臨床實(shí)踐證明,中醫(yī)辨證論治銀屑病能夠取得良好療效,而與西醫(yī)診治具有互補(bǔ)性。既往我們對銀屑病的中醫(yī)證候分類規(guī)律和用藥規(guī)律進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)血熱證是銀屑病最常見的證型,生地黃是治療其最常用的中草藥[1]?;谖覀兗韧W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究基礎(chǔ)[2,3],本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法,預(yù)測生地黃治療銀屑病的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,為探索中藥多靶點(diǎn)治療病證的機(jī)制研究提供方法學(xué)參考。

    1 材料與方法

    從中華人民共和國藥典(2005版)中查詢生地黃的有效成分,從美國國家衛(wèi)生研究所(NIH)建立的小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.Ncbi.him.nih.gov)和基因數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)分別檢索生地黃各個(gè)有效成分對應(yīng)人類活性靶蛋白和銀屑病相關(guān)基因(檢索日期:2012年8月29日),將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入IPA(Ingenuity Pathway Analysis)數(shù)據(jù)分析平臺(tái),運(yùn)行“core analysis”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并得到相關(guān)結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 生地黃靶蛋白及靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

    表1顯示,通過檢索PubChem數(shù)據(jù)庫找到生地黃共有7個(gè)靶蛋白。通過IPA軟件構(gòu)建這些靶蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖1)。該網(wǎng)絡(luò)主要展示“與癌癥形成及細(xì)胞生長與死亡相關(guān)的分子”相互關(guān)系特征,提示這些靶蛋白參與癌癥形成及細(xì)胞生長與死亡的調(diào)控。

    表1 生地黃靶標(biāo)蛋白

    2.2 銀屑病相關(guān)基因生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)及功能

    表2顯示,通過檢索 gene數(shù)據(jù)庫,共得到165個(gè)銀屑病相關(guān)基因。把這些基因?qū)隝PA軟件,共能構(gòu)建15個(gè)分子相互作用網(wǎng)絡(luò),這些分子主要涉及3個(gè)經(jīng)典通路,其中涉及銀屑病相關(guān)基因最多的是網(wǎng)絡(luò)(圖2)中的基因及核轉(zhuǎn)錄因子 κB(Nuclear Factor Kappa binding,NF-κB)信號(hào)通路(圖 4)中的相關(guān)基因。圖2主要展示“與皮膚炎癥、結(jié)締組織病變相關(guān)的分子”相互關(guān)系特征,提示這些基因參與皮膚炎癥、結(jié)締組織的調(diào)控。

    圖1 生地黃靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

    2.3 銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與分子網(wǎng)絡(luò)及生物學(xué)通路

    在IPA系統(tǒng)的Comparison功能中,比較銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與的分子網(wǎng)絡(luò)及生物學(xué)通路。圖3顯示,腫瘤抑制蛋白(TP53)、核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP1)及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)是銀屑病和生地黃共同關(guān)聯(lián)的分子,提示生地黃可能主要通過調(diào)節(jié)這些分子對銀屑病發(fā)揮治療作用。圖4顯示,NF-κB信號(hào)通路是銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與的生物學(xué)通路,但它們作用的靶點(diǎn)并不盡相同,提示生地黃靶蛋白GSK3B通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路對銀屑病發(fā)揮治療作用。

    表2 銀屑病相關(guān)主要基因

    圖2 銀屑病相關(guān)基因分子網(wǎng)絡(luò)

    圖3 “生地黃靶蛋白-銀屑病相關(guān)基因”分子網(wǎng)絡(luò)

    3 討論

    蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein Interaction Network)是研究生物功能或病理變化分子基礎(chǔ)的新途徑和新方法,也是目前國際上生物信息學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[4,5]。發(fā)現(xiàn)并建立與疾病相關(guān)的分子作用網(wǎng)絡(luò),對于認(rèn)識(shí)復(fù)雜疾病至關(guān)重要,也是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究所面臨的重大挑戰(zhàn)[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基本思路是理解疾病“表型-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用的網(wǎng)絡(luò)特征,通過網(wǎng)絡(luò)分析觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響,尋找可能的組合藥物靶標(biāo),預(yù)測最優(yōu)化的組合藥物[2]?;诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)鍵技術(shù)研究,對于預(yù)測藥效及藥理機(jī)制既是方法學(xué)創(chuàng)新,又具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益[7]。許多復(fù)雜性疾病,如心血管疾病、腫瘤、糖尿病、銀屑病等是由多基因、多功能蛋白相互作用紊亂而形成的疾病網(wǎng)絡(luò)。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)及系統(tǒng)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)功能特征,探索中藥對疾病的調(diào)控機(jī)制與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路有許多相似之處[8]。因此,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法探索生地黃治療銀屑病的分子機(jī)制。

    圖4 銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與的NF-κB信號(hào)通路

    PubChem數(shù)據(jù)庫和Gene數(shù)據(jù)庫是由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)建立的公共數(shù)據(jù)庫[9]。通過其中豐富的化合物、生物活性信息和疾病相關(guān)基因信息,以及數(shù)據(jù)庫自身對這些信息進(jìn)行整合分析的功能,檢索生地黃有效成分靶蛋白和銀屑病相關(guān)基因作為我們構(gòu)建生地黃靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和銀屑病疾病網(wǎng)絡(luò)的分子基礎(chǔ)。IPA生物分析軟件能夠分析、整合、理解來自于基因表達(dá)等系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)等的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),能夠搜索到有關(guān)基因、蛋白質(zhì)、化學(xué)品和藥物的信息,并能建立起實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的交互模型[10]。在本研究中,我們除了利用IPA平臺(tái)構(gòu)建生地黃靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和銀屑病疾病網(wǎng)絡(luò),同時(shí)利用 IPA軟件中Comparison Analysis的分析功能對這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)二者網(wǎng)絡(luò)的異同點(diǎn)以及二者生物學(xué)通路的異同點(diǎn),進(jìn)而尋找生地黃治療銀屑病的生物學(xué)基礎(chǔ)。

    本研究結(jié)果顯示,生地黃可能主要通過調(diào)節(jié)TP53、NF-κB、TNF、MMP1 和 MMP2 五個(gè)分子,以及重組人糖原合成酶激酶3β(GSK3B)參與的 NF-κB信號(hào)通路對銀屑病發(fā)揮治療作用。TP53是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的重要蛋白[11],能有效地調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞的增殖周期,而銀屑病皮損中P53蛋白均表達(dá)異常[12,13],調(diào)控機(jī)制失去平衡,成為表皮增殖紊亂的重要原因[14]。腫瘤壞死因子(TNF)基因是一種既能直接殺死腫瘤細(xì)胞,又能通過激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用的細(xì)胞因子。TNF-a出現(xiàn)在炎癥反應(yīng)初期,是機(jī)體炎癥與免疫反應(yīng)應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。TNF-α在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中有著重要作用,是銀屑病炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素[15,16],參與銀屑病的啟動(dòng)、維持和復(fù)發(fā),且與浸潤的細(xì)胞成分及角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖有關(guān)[17]。金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinase,MMPs)是一類結(jié)構(gòu)中含 Zn+和 Ca2+的蛋白水解酶類,是細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解主要酶類之一。近年來有研究表明,MMPs是銀屑病的新生血管形成的重要因素,在銀屑病的發(fā)病中起重要作用[18,19]。NF-κB 是一種作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控眾多的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá),調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞,從而參與調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的生理、病理反應(yīng)[20,21]。免疫介導(dǎo)是銀屑病的主要發(fā)生機(jī)制,銀屑病患者皮損區(qū)一些細(xì)胞因子及黏附分子表達(dá)異常,其中包括 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α 和神經(jīng)生長因子(NGF)等[22],而這些因子編碼基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上都有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。慢性銀屑病斑塊中 NF-κB活化缺陷與皮損的形成有關(guān)[23]。NF-κB p65 的異常表達(dá)與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)[24,25]。總之,銀屑病疾病位點(diǎn)和生地黃干預(yù)靶點(diǎn)都能體現(xiàn)在相同的分子網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上,干預(yù)這些分子網(wǎng)絡(luò)和通路中的相同或不同的關(guān)鍵分子,進(jìn)而影響整個(gè)網(wǎng)絡(luò)或通路的生物學(xué)功能,這也許就是生地黃治療銀屑病的分子生物學(xué)機(jī)制之一。生地黃是治療血熱證銀屑病最主要的中草藥[1],以藥測證,可以推斷上述生地黃的作用靶標(biāo),也可能反映了血熱證的生物學(xué)特征。

    總之,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為探索中藥治療疾證分子機(jī)制開辟了一條高通量途徑,為中藥有效成分篩選及探索效應(yīng)機(jī)制,進(jìn)而為臨床用藥及新藥研發(fā)提供了新思路和新方法。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍處于起步發(fā)展階段,其研究手段、計(jì)算方法及應(yīng)用軟件還有待進(jìn)一步探索,基于大量數(shù)據(jù)庫和算法構(gòu)建的分子網(wǎng)絡(luò)及藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[26]。

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