新型核苷衍生物十八烷氧乙基替諾福韋酯的體內(nèi)外抗乙型肝炎病毒作用研究

李思陽，李壯，陳淑珍，章天，王淑琴，李毅，陶佩珍，李卓榮

核苷（酸）類似物（NAs）是乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶抑制劑，它通過與內(nèi)源性底物的競爭性結(jié)合或是嵌入病毒 DNA 作為鏈終止來發(fā)揮其抗病毒作用，是目前抗 HBV的主要藥物品種之一。NAs 可以有效地降低細(xì)胞中 HBV的DNA 含量到檢測水平以下，并且可以大幅改善臨床及病理組織學(xué)表現(xiàn)[1]。但是，該類藥物普遍存在腎臟毒性較大、易產(chǎn)生耐藥和有交叉耐藥等問題。替諾福韋（TFV）是無環(huán)腺嘌呤單核苷酸衍生物，是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶或 DNA 聚合酶抑制劑，但由于其結(jié)構(gòu)中磷酸基帶負(fù)電荷，極性太強(qiáng)，生物膜透過性差，導(dǎo)致生物利用度很低，使其不能成為藥物應(yīng)用于臨床[2]。替諾福韋雙異丙酰氧基甲酯富馬酸鹽（TFV-DF，圖 1）為其雙酯性前藥，生物利用度有了一定的提高，但也只有 25%～40%（取決于飲食中脂肪含量）[3]。

替諾福韋的磷酸十八烷氧乙基單酯衍生物（octadecyloxyethyl-tenofovir，ODE-TFV，圖 1），是抗 HBV 候選化學(xué)藥物的一種新型結(jié)構(gòu)。ODE-TFV 與TFV-DF 同為前藥化合物，吸收進(jìn)入體內(nèi)后游離出活性成分 TFV 發(fā)揮抗病毒作用。因此，在應(yīng)對臨床病毒耐藥性問題上，該藥將具有與TFV-DF 及TFV 相似的特點(diǎn)，即藥物本身不易發(fā)生耐藥、與拉米夫定等環(huán)狀核苷無交叉耐藥。與臨床藥物 TFV-DF 相比，研究結(jié)果顯示，ODE-TFV具有更強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性和更高的口服生物利用度。本研究即是評價(jià) ODE-TFV 在乙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系 2.2.15 細(xì)胞和鴨肝炎病毒（DHBV）感染雛鴨模型中抗 HBV的活性，并評價(jià)其對肝臟病理的改善效果，為進(jìn)一步的研究開發(fā)提供藥效學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 藥物 ODE-TFV 由本研究組分批合成，純度為93.8%～97.2%。TFV-DF 由本研究組制備合成，純度 98.7%，以 0.3% 羧甲基纖維素鈉制備成懸液備用。陽性藥物拉米夫定（3TC）為英國 Glaxo Wellcome公司生產(chǎn)，批號：2005110011，用生理鹽水配制實(shí)驗(yàn)用溶液。

圖1 ODE-TFV 及TFV-DF結(jié)構(gòu)式Figure1 Chemical structure of ODE-TFV and TFV-DF

1.1.2 細(xì)胞 乙型肝炎病毒 DNA 克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞（Hep G2）的2.2.15 細(xì)胞系由美國 Mount Sinai 醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，本所病毒室引進(jìn)后自行傳代培養(yǎng)。

1.1.3 試劑及儀器 放射性同位素 α32P dCTP 為美國 PE公司產(chǎn)品，比活度為9.25 MBq；探針標(biāo)記用的隨機(jī)引物試劑盒購自美國 Promega公司；Sephadex G-50，F(xiàn)icoll PVP 購自瑞典 Pharmacia公司；SDS 為德國 Merck公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白購自中國科學(xué)院生物物理所；0.45 μmol/L的硝酸纖維素膜是瑞典 Amersham公司的產(chǎn)品。

1.1.4 病毒 鴨乙型肝炎病毒 DNA（DHBVDNA）陽性鴨血清采自上海麻鴨，–70 ℃ 保存。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1 日齡北京鴨，購自北京前進(jìn)種鴨飼養(yǎng)場。

1.2 方法

1.2.1 在2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)中對 HBV-DNA的抑制試驗(yàn)

1.2.1.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) ODE-TFV 配成10 mmol/L的母液，用 2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)液配成所需濃度，然后用培養(yǎng)液從 200 μmol/L 開始 3 倍稀釋，共 4個(gè)濃度，加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每濃度 3 孔，每 4 天換同濃度藥液，設(shè)空白對照組，培養(yǎng) 8 d。顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，完全破壞為4；75% 破壞為3；50% 破壞為2；25% 破壞為1；無病變?yōu)?。計(jì)算每濃度藥液平均細(xì)胞病變程度和抑制率。按 Reed & Muench 法計(jì)算半數(shù)毒性濃度（TC50）。

1.2.1.2 HBV-DNA的抑制試驗(yàn) 各濃度組藥液及細(xì)胞對照組的2.2.15 細(xì)胞上清液按分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法提取 HBV-DNA，各樣品分別進(jìn)行斑點(diǎn)雜交、放射自顯影，用酶標(biāo)檢測儀測定 IOD 值，計(jì)算血清 HBV-DNA 密度，以雜交斑點(diǎn) IOD 值作為標(biāo)本 HBV-DNA 水平值，計(jì)算 HBV-DNA 抑制率、半數(shù)有效濃度（IC50）和選擇指數(shù)（SI）。本實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值。

HBV-DNA 抑制率（%）=（IOD細(xì)胞對照－IOD給藥組）/ IOD細(xì)胞對照×100%。

1.2.2 在鴨肝炎病毒感染雛鴨模型中對 DHBVDNA的抑制試驗(yàn)

1.2.2.1 鴨乙型肝炎病毒感染 1 日齡北京鴨，經(jīng)腿脛靜脈注射上海麻鴨 DHBV-DNA 陽性鴨血清，每只 0.2ml。感染后第 7 天取血，分離血清，置于–70 ℃ 保存待檢（T0）。

1.2.2.2 藥物治療試驗(yàn) 將 48只感染鴨按隨機(jī)區(qū)組分組法[4]分為8組：病毒對照組；ODE-TFV高、中、低劑量組（200、100和50 mg/kg）；陽性藥 TFV-DF 高、低劑量對照組（200和100 mg/kg）；陽性藥 3TC 高、低劑量對照組（80和40 mg/kg）。所有藥物均灌胃給藥，每日 2 次，共給藥 14 d，分別在感染后第 7 天即給藥前（T0），給藥后第7 天（T7），第 14 天（T14）及停藥后的第 3 天（P3），自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，置–70 ℃ 保存待檢。

1.2.2.3 檢測方法 取上述待檢鴨血清，每批同時(shí)點(diǎn)膜，測定鴨血清中 DHBV-DNA 水平的動(dòng)態(tài)變化。按試劑盒說明書方法，用32P 標(biāo)記 DHBV-DNA探針，并作鴨血清斑點(diǎn)雜交，放射自顯影膜片斑點(diǎn)，以雜交斑點(diǎn) IOD 值作為標(biāo)本 HBV-DNA 水平值。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)處理 計(jì)算每組鴨不同時(shí)間血清DNA IOD 值的平均值，以表示，并將每組鴨用藥后不同時(shí)間（T7、T14）和停藥后第 3 天（P3）的血清 DHBV-DNA 水平與同組給藥前（T0）IOD值比較，采用配對 t 檢驗(yàn)，計(jì)算 t1、P1值。分析差異的顯著性，判斷藥物對病毒感染的抑制效果。計(jì)算每組鴨用藥后不同時(shí)間（T7、T14）和停藥第 3 天（P3）的血清 DHBV-DNA的抑制率。

血清 DHBV-DNA 抑制率（%）=（IOD給藥前－IOD給藥后）/IOD給藥前×100%。

將給藥治療組不同時(shí)間的DHBV-DNA 抑制率分別與病毒對照組相同時(shí)間的DHBV-DNA 抑制率作比較，采用成組t 檢驗(yàn)，作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算 t2、P2值，分析差異的顯著性，判斷藥效。

1.2.3 對肝組織病理學(xué)改善作用的試驗(yàn) 鴨乙型肝炎病毒的感染和給藥方法同 1.2.2.2，陽性對照藥3TC的劑量改用 35、70 mg/kg，給藥 14 d，停藥，即刻殺死小鴨，取肝臟。經(jīng)固定、脫水、包埋后進(jìn)行切片，染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝臟病理變化并進(jìn)行比較。在細(xì)胞浸潤觀察中，±表示基本未見或有微量炎細(xì)胞浸潤；+ 表示少量炎細(xì)胞浸潤；++ 表示中等量炎細(xì)胞浸潤或少量炎細(xì)胞浸潤加片狀炎細(xì)胞浸潤；+++ 表示大量炎細(xì)胞浸潤或中等量炎細(xì)胞浸潤加片狀炎細(xì)胞浸潤。在肝細(xì)胞彌漫性氣球樣變性的觀察中，–表示基本未見肝細(xì)胞彌漫性氣球樣變性；+ 表示肝細(xì)胞彌漫性氣球樣變性。在肝細(xì)胞灶性壞死的觀察中，–表示基本未見肝細(xì)胞呈灶性壞死；+ 表示肝細(xì)胞呈灶性壞死。

2 結(jié)果

2.1 在2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)中對 HBV-DNA的抑制作用

樣品對 2.2.15 細(xì)胞 TC50及在2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)中對 HBV-DNA的抑制作用的結(jié)果見表1。由表1 可知，ODE-TFV 對 HBV-DNA 復(fù)制顯示出強(qiáng)抑制活性，較陽性對照藥 TFV-DF和3TC 分別提高約 18 倍和13 倍，ODE-TFV的選擇指數(shù)也明顯高于TFV-DF。

2.2 在鴨肝炎病毒感染雛鴨模型中對 DHBV-DNA的抑制作用

實(shí)驗(yàn)藥物對鴨血清 DHBV-DNA的抑制作用見表2。本批實(shí)驗(yàn)感染鴨共 48只，血清 DHBVDNA 全部呈陽性。病毒對照組6只雛鴨在實(shí)驗(yàn)全程 24 d 內(nèi)血清 DHBV-DNA 水平感染后基本平穩(wěn)。全程不同時(shí)間血清 DHBV-DNA 有自然波動(dòng)。ODE-TFV 100 mg/kg組鴨血清 DHBV-DNA 抑制率與病毒對照組相比，在T7、P3有顯著性差別（P＜0.05）。ODE-TFV 200 mg/kg組在T7、P3血清DHBV-DNA 抑制率與病毒對照組比較，有顯著性和非常顯著性差別（P＜0.05、P＜0.01）。陽性對照藥 TFV-DF 200 mg/kg組在P3血清 DHBV-DNA抑制水平與病毒對照組相比，有顯著性意義（P＜0.05），其他時(shí)間段成組對比，雖有抑制作用，但無顯著性差異。對照藥 3TC 40 mg/kg組在T7、T14，鴨血清 DHBV-DNA 抑制率與病毒對照組相比，有顯著性意義（P＜0.05）。3TC 80 mg/kg組在T7、T14，鴨血清 DHBV-DNA 抑制率與對照組相比，均有顯著性差別（P＜0.05）。

表1 ODE-TFV、TFV-DF和3TC 在2.2.15 細(xì)胞中的細(xì)胞毒性與對 HBV-DNA的抑制作用Table1 Cytotoxicity and inhibitory effects of ODE-TFV,TFV-DF and 3TC on HBV-DNA in cell line 2.2.15

如若把給藥劑量單位由 mg/kg 折算成 mol/kg，3 種試驗(yàn)藥物的給藥劑量分別為：ODE-TFV 為0.086、0.17和0.34 mol/kg；TFV-DF 為0.17和0.32 mol/kg；3TC 為0.18和0.35 mol/kg。在幾乎等摩爾劑量下（0.17和約 0.34 mol/kg），ODE-TFV在T7、3TC 在T7和T14對 DHBV-DNA 復(fù)制顯示出明顯的抑制作用，而在停藥后第 3 天，ODE-TFV 治療組仍然顯示出一定的持續(xù)抑制病毒作用，3TC 治療組停藥后鴨血清病毒 DNA 水平明顯反跳。

表2 ODE-TFV 對鴨血清 DHBV-DNA的抑制作用Table2 Inhibition effect of ODE-TFV on duck serum DHBV-DNA

圖2 ODE-TFV 對 DHBV 感染的鴨肝臟病理學(xué)的影響（20×）Figure2 Hepatic pathologic effects of ODE-TFV on DHBV infected duck liver (20×)

表3 鴨肝臟光學(xué)顯微鏡檢查結(jié)果Table3 The result of ducks liver inspected by optical microscope

2.3 對 DHBV 感染雛鴨的肝臟病理改善效果

DHBV 感染雛鴨模型體內(nèi)抑制病毒作用實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，留取實(shí)驗(yàn)肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)觀察（圖 2和表 3）。病毒對照組鴨肝病理切片經(jīng) HE 染色后，可觀察到的主要病變?yōu)楦闻K細(xì)胞氣球樣變性、肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤。ODE-TFV 治療組的鴨肝臟病理切片顯示，炎癥細(xì)胞的浸潤和肝細(xì)胞壞死得到顯著改善，肝竇內(nèi)炎細(xì)胞浸潤的改善存在一定的劑量關(guān)系，劑量越大，改善越明顯（圖 2B、2C、2D）；TFV-DF組，炎細(xì)胞浸潤和對照組相比有所改善，但不如相同劑量的ODE-TFV組改善明顯（圖 2E、2F）；3TC組病理結(jié)果表明，3TC 可以一定程度改善肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤，不過，其改善效果也不如 ODE-TFV各組明顯（圖 2G、2H）。但是，所有給藥組對鴨肝細(xì)胞氣球樣變性均沒有明顯改善。

3 討論

本研究對 ODE-TFV 體外活性的評價(jià)是以人肝癌細(xì)胞系 2.2.15 細(xì)胞作為模型，以陽性藥物TFV-DF和3TC 作為對照，檢測目標(biāo)化合物ODE-TFV的抗病毒效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi) ODE-TFV 對 HBV-DNA的抑制活性較 TFV-DF和3TC 分別強(qiáng)約 18 倍和13 倍，體現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制病毒復(fù)制的作用。但是，2.2.15細(xì)胞模型也存在一定的缺陷：不同于自然感染，在該細(xì)胞株中，HBV 基因組整合在宿主細(xì)胞的染色體上；復(fù)制方式與自然感染不同，并且很難被清除；病毒的復(fù)制水平不能人為改變，并且復(fù)制水平低；2.2.15 細(xì)胞雖再現(xiàn)了 HBV 在肝細(xì)胞的復(fù)制和表達(dá)，但脫離了機(jī)體免疫系統(tǒng)對 HBV 產(chǎn)生影響的環(huán)境。因此，應(yīng)用該模型進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究只能反映出藥物對 HBV的直接抑制作用，但不能反映藥物通過免疫功能來發(fā)揮間接抗 HBV的作用[5]。

本研究利用 DHBV 感染雛鴨模型評價(jià)ODE-TFV 體內(nèi)抗病毒活性及改善肝臟病理的作用。研究結(jié)果顯示，ODE-TFV 低劑量組未表現(xiàn)出明顯的抗病毒活性，ODE-TFV的中、高劑量組對DHBV-DNA的復(fù)制有明顯的抑制作用。同時(shí)，我們也觀察了 ODE-TFV 在鴨體內(nèi)對 DHBV 感染的肝臟病理學(xué)的改善，結(jié)果表明，ODE-TFV能夠有效改善 DHBV 引起的肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤，有一定量效關(guān)系。綜合以上研究結(jié)果，我們不難發(fā)現(xiàn)，ODE-TFV 作為新的非環(huán)核苷類抗病毒化合物，在體內(nèi)外對 HBV 均具有明顯的抑制活性和改善肝臟病理的作用，與對照藥 TFV-DF 及3TC相比較，也有較好的抗病毒效果，值得進(jìn)一步深入研究。

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