HPLC法測(cè)定獸用白頭翁顆粒中白頭翁皂苷B4含量*

張 穎，韋旭斌，沈志強(qiáng)

(1.吉林大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062； 2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

白頭翁顆粒是以傳統(tǒng)方劑“白頭翁湯”為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代制劑技術(shù)制備出的一種新型制劑。由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4味藥組成，具有清熱解毒、涼血止痢之功效，主治濕熱泄瀉，下痢膿血[1]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯及其主要成分具有抗菌[2-3]、抗炎、抗腹瀉[4]、抗細(xì)菌內(nèi)毒素[5]、抗腫瘤[6]及促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)[7]等作用。在獸醫(yī)臨床上主要用于熱痢、腹痛、里急后重等癥的治療。方中白頭翁為君藥，白頭翁皂苷B4為白頭翁中主要有效成分[8]，其含量測(cè)定方法主要有RT-HPLC法[9]、HPLC-ELSD聯(lián)用[10]和薄層掃描法[11]以及運(yùn)用HPLC指紋圖譜法提供了白頭翁湯顆粒劑的特征性圖譜[12]，但對(duì)白頭翁湯制劑中白頭翁皂苷B4的含量測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在采用HPLC法測(cè)定白頭翁顆粒中白頭翁皂苷B4的含量，為該制劑的質(zhì)量研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀 器

Agilent 1260 高效液相色譜儀(G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，UV檢測(cè)器)，BS110型電子天平(北京賽多利斯)、SB3200超聲波清洗器(上海寧波新芝生物技術(shù)研究所)。

1.2 藥品與試劑

白頭翁顆粒(中試樣品，山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：20120913、20121015、20121224)；純化水(山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司)；白頭翁皂苷B4對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111766-20601)。

甲醇(色譜純，山東歐化化工有限公司)、乙腈(色譜純，山東歐化化工有限公司)、磷酸(分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)、乙醇(分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱：HypersilC18(250 mm×4.6 mm,5 μL)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(27：73，V/V)；流速1.0 mL/min ，柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，進(jìn)樣量20 μL；理論板數(shù)不低于3000(按白頭翁皂苷B4計(jì))。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取白頭翁皂苷B410.0 mg，置于5 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度線，搖勻，即得對(duì)照品溶液，濃度2.0 mg/mL，備用。

1.4.2 供試品溶液 稱(chēng)取白頭翁顆粒粉末1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理15 min，待冷卻后過(guò)濾，取濾液水浴揮干，放冷，加流動(dòng)相適量將其溶解，置10 mL量瓶中，稀釋定容，作為供試品溶液，備用。

1.4.3 陰性對(duì)照溶液 稱(chēng)取未加白頭翁藥材制備的白頭翁顆粒粉末1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理15 min，待冷卻后過(guò)濾，取濾液水浴揮干，放冷，加流動(dòng)相適量將其溶解，置于10 mL量瓶中，稀釋定容，即得缺白頭翁的陰性對(duì)照溶液，備用。

1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄白頭翁皂苷B4色譜圖。

1.6 線性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取白頭翁皂苷B4對(duì)照品15 mg，置5 mL量瓶，流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相倍比稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以白頭翁皂苷B4的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并作回歸分析。

1.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)定已知含量的白頭翁顆粒樣品9份(批號(hào)：20121224)，按“1.4.2”項(xiàng)下處理，制成樣品溶液，精密稱(chēng)取白頭翁皂苷B4對(duì)照品分別加入樣品溶液中，制成高、中、低不同濃度的加標(biāo)樣品溶液9份，備用。按上述色譜條件，取加標(biāo)樣品溶液各20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖并計(jì)算回收率。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

1.8.1 儀器精密度 在上述色譜條件下，取2.0 mg/mL的白頭翁皂苷B4對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖劑及白頭翁皂苷B4色譜峰面積。

1.8.2 重現(xiàn)性 取同一批樣品6份，每份精密稱(chēng)取1.0 g(批號(hào)：20121224),按“1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述相同色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL，記錄并比較供試品溶液中白頭翁皂苷B4的峰面積值。

1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將“1.8.2”項(xiàng)下的供試品溶液于室溫條件下放置，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)各進(jìn)樣20 μL，記錄圖譜并比較供試品溶液中白頭翁皂苷B4含量測(cè)定值。

1.10 樣品含量測(cè)定

分別精密稱(chēng)取3個(gè)批次(批號(hào)：20120913、20121015、20121224)白頭翁顆粒樣品1 g，依照“1.4.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定供試品溶液中白頭翁皂苷B4的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 專(zhuān)屬性

供試品溶液中白頭翁皂苷B4色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品溶液一致(約18.0 min)且陰性對(duì)照色譜圖上無(wú)色譜峰出現(xiàn)。供試品溶液中白頭翁皂苷B4色譜峰與相鄰色譜峰的分離度R>1.5；拖尾因子處于0.95～1.05之間，結(jié)果見(jiàn)圖1。

A 對(duì)照品溶液 Reference solution B 供試品溶液Test solution圖1 白頭翁皂苷B4 色譜圖Fig.1 Chromatogram of Pulchinenoside B4

2.2 線性關(guān)系

以白頭翁皂苷B4質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)所做標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=4016x+71.36(r=0.9995, n=6)。結(jié)果表明，白頭翁皂苷B4在質(zhì)量濃度0.1～2.0 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3 加樣回收率

按外標(biāo)法以白頭翁皂苷B4含量計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。樣品中白頭翁皂苷B4的平均回收率為99.28%(RSD =2.09%，n=9),說(shuō)明該方法回收率高，準(zhǔn)確度好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，白頭翁皂苷B4峰面積的RSD值為1.33%(n=5)，表明儀器精密度好。重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。測(cè)得6份樣品中白頭翁皂苷B4含量的RSD值為1.06%(n=6)，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

圖2 白頭翁皂苷B4標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of Pulchinenoside B4

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

相同色譜條件下，不同時(shí)間段(0、1、3、6、12、24 h)測(cè)得同一白頭翁皂苷B4對(duì)照品溶液色譜峰面積的RSD值為0.46%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)白頭翁皂苷B4含量較穩(wěn)定，同時(shí)也說(shuō)明該試驗(yàn)方法穩(wěn)定性較好。

2.6 樣品含量測(cè)定

在相同試驗(yàn)條件下，樣品中白頭翁皂苷B4的平均含量為11.29mg/g(RSD =0.77%，n=9)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，不同批次樣品中測(cè)得白頭翁皂苷B4的含量差異不顯著，約為11 mg/g。

表1 樣品加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 The results of sample recovery test

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 The results of repeatability test

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=9)Table 3 The results of content sample test

3 討 論

白頭翁顆粒中化學(xué)成分復(fù)雜，檢測(cè)易受干擾。試驗(yàn)中曾對(duì)3個(gè)流動(dòng)相體系(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸)進(jìn)行了比較，并參照白頭翁湯顆粒的指紋圖譜[12]，綜合考察峰形、分離度、拖尾因子、保留時(shí)間等因素，以流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸(27：73，V/V)為最佳。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9-10,13]，制劑中白頭翁皂苷B4的含量測(cè)定方法主要為：紫外高效液相色譜法(HPLC-UV)和蒸發(fā)光散射高效液相色譜法(HPLC-ELSD)。ELSD檢測(cè)器雖是通用型檢測(cè)器但使用范圍小，而紫外檢測(cè)器(UVD)的應(yīng)用具有廣泛性，在200～400 nm范圍內(nèi)有紫外吸收的物質(zhì)均可考慮使用。與HPLC-ELSD法相比，本試驗(yàn)所采用HPLC-UV操作更簡(jiǎn)單、方便。同時(shí)，本試驗(yàn)所建方法的樣品色譜圖中白頭翁皂苷B4色譜峰與相鄰色譜峰分離度高，且無(wú)脫尾現(xiàn)象，與RT-HPLC法[9]比較，其專(zhuān)屬性強(qiáng)，結(jié)果更準(zhǔn)確、重現(xiàn)性最佳，為白頭翁顆粒質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化提供了科學(xué)依據(jù)。

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