響應(yīng)面法優(yōu)化畜禽用凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基*

高書鋒，張德元，陳海榮，孫翔宇，周映華，胡新旭，周小玲，劉惠知

(湖南省微生物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410009)

近年來抗生素作為飼料添加劑導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品質(zhì)量及環(huán)境藥物殘留等問題十分突出[1-2]。微生態(tài)制劑已成為一種新型抗生素替代品[3]，國(guó)家政策大力支持其在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是近年來益生菌領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，除具乳酸菌和雙歧桿菌等保健功效外[4]，還具抗逆性強(qiáng)、耐高溫和易貯存等芽孢桿菌所具有的獨(dú)特性[5]，在國(guó)外已廣泛應(yīng)用于保健、醫(yī)療、食品和畜牧等領(lǐng)域[6]。凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽添加劑方面的應(yīng)用報(bào)道日益增多，但有關(guān)其產(chǎn)業(yè)化方面的報(bào)道相對(duì)較少。本文通過Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)影響因子進(jìn)行考察和評(píng)價(jià)，然后對(duì)關(guān)鍵影響因素進(jìn)行最陡爬路徑試驗(yàn)，進(jìn)一步采用響應(yīng)面法研究和探討及其交互作用，獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

凝結(jié)芽孢桿菌菌種由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 主要設(shè)備

DGX-9143B-1電熱恒溫干燥箱、BH-2型OLYMPUS顯微鏡、PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)、WJ-250B生化培養(yǎng)箱、ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器等。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 斜面培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂18 g/L，pH=7.0-7.2。

1.3.2 種子培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L， pH=7.0-7.2。

1.3.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、一水硫酸錳 0.169 g/L、硝酸鈉 0.34 g/L和七水硫酸鎂 0.74 g/L，pH=7.0-7.2。

1.4 培養(yǎng)方法

將凝結(jié)芽孢桿菌保藏菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24 h，備用。取3環(huán)活化菌種，接入裝有75 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)20 h。

1.5 菌體數(shù)及芽孢數(shù)檢測(cè)

發(fā)酵液取樣，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，傾注法檢測(cè)含菌量，重復(fù)3次，檢測(cè)菌體數(shù)。取10 mL發(fā)酵液，置90 mL無菌水中，80 ℃水浴熱處理15 min，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，傾注法檢測(cè)芽孢的形成量，重復(fù)3次，檢測(cè)芽孢數(shù)。芽孢率為芽孢數(shù)與菌體數(shù)的比值。檢測(cè)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母膏10 g，瓊脂18 g，鹽溶液10 mL(1 mL鹽溶液含：七水硫酸鎂5 mg，一水硫酸錳1 mg，碳酸鈣2 mg，氯化鈉5 mg)。

1.6 不同培養(yǎng)基對(duì)凝結(jié)孢桿菌發(fā)酵水平的影響

1.6.1 碳源對(duì)發(fā)酵水平的影響 以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的碳含量計(jì)算碳濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源分別用蔗糖、淀粉、葡萄糖、麥麩和糖蜜替換，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測(cè)發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.6.2 氮源對(duì)芽孢發(fā)酵水平的影響 以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨含量計(jì)算氮濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源分別用蛋白胨、酵母膏、大豆粉、魚粉、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比為1:1)、硝酸鉀和硫酸銨替換，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測(cè)發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.6.3 碳氮比對(duì)發(fā)酵水平的影響 將優(yōu)化得到的最佳碳源和復(fù)合氮源分別按4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳氮源，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測(cè)發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.6.4 復(fù)合氮源(大豆粉和魚粉)對(duì)發(fā)酵水平的影響 經(jīng)上述優(yōu)化，得到最佳氮源為大豆粉和魚粉、質(zhì)量比為1∶1，改變大豆粉和魚粉質(zhì)量比例，研究不同質(zhì)量比例的大豆粉和魚粉對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響，選取5種不同質(zhì)量比例的大豆粉和魚粉進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)， 5種不同質(zhì)量比例(大豆粉：魚粉)分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3。接種量為5%，裝液量為15%，置35℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測(cè)發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.6.5 無機(jī)鹽對(duì)芽孢形成率的影響 去掉基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽，分別添加0.002 mol/L硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈉、三氯化鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、碳酸鈣和硝酸鈉，以不加任何無機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測(cè)發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.7 影響凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的重要因素篩選

根據(jù)碳氮源單因素篩選試驗(yàn)及無機(jī)鹽單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Plackett-Burman(P-B)兩水平法，選用試驗(yàn)次數(shù)N=12試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)碳源、氮源和無機(jī)鹽6種因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素各取兩個(gè)水平，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液菌體數(shù)進(jìn)行響應(yīng)，篩選影響凝結(jié)芽孢桿菌活菌體數(shù)的重要因素，以期確定最佳配方，設(shè)計(jì)因素及水平見表1。根據(jù)P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案配制培養(yǎng)基，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測(cè)發(fā)酵液菌體數(shù)。

表1 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Levels and factors of the Plackett-Burman design

1.8 最陡爬坡路徑逼近響應(yīng)區(qū)試驗(yàn)

根據(jù)P-B試驗(yàn)結(jié)果，用Minitab軟件對(duì)P-B試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，確定主要影響因子，在其它因素保持原始水平不變下，對(duì)淀粉、大豆粉+魚粉和磷酸氫二鉀進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，根據(jù)所得一次回歸方程安排最陡爬坡試驗(yàn)，一次回歸方程系數(shù)正負(fù)和大小確定爬坡方向和步長(zhǎng)，系數(shù)為負(fù)，則該因素水平為遞減，反之遞增，系數(shù)越大變化越小，盡而快速的接近最大響應(yīng)區(qū)域[7]。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表8，分別按表8配制培養(yǎng)基，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測(cè)發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.9 響應(yīng)面分析法確定最大響應(yīng)值

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，對(duì)淀粉、魚粉和磷酸氫二鉀進(jìn)行中心試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)，運(yùn)用Minitab軟件采用Box-Behnken法，創(chuàng)建響應(yīng)面設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析，中心點(diǎn)3次重復(fù)。響應(yīng)面分析因素及水平見表2，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案配制培養(yǎng)基，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測(cè)發(fā)酵液菌體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分對(duì)凝結(jié)孢桿菌發(fā)酵水平的影響

2.1.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵水平的影響 不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響結(jié)果見表3。由表3知，碳源為葡萄糖時(shí)菌體數(shù)最高，為25.8×108CFU/mL，碳源為淀粉時(shí)菌體數(shù)次之，為23.2×108CFU/mL，考慮到碳源為淀粉時(shí)，菌體數(shù)和葡萄糖差異不大，且芽孢率和芽孢數(shù)均最高，分別為55.17%和12.8×108CFU/mL，因此選擇淀粉為發(fā)酵最佳碳源。

2.1.2 不同氮源對(duì)發(fā)酵水平的影響 由表4可知，大豆粉+魚粉、魚粉和大豆粉為氮源時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌菌體數(shù)和芽孢率均較高，菌體數(shù)分別為39.5×108CFU/mL、37.8×108CFU/mL和33.4×108CFU/mL；芽孢率分別為63.29%、62.43%和64.97%；硝酸鉀和硫酸銨為氮源時(shí)，菌體數(shù)和芽孢率都比較低，可見有機(jī)氮源和無機(jī)氮源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌菌體數(shù)和芽孢率的影響差異很大，因此選用有機(jī)復(fù)合氮源大豆粉+魚粉(1:1)為凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵最佳氮源。

表2 響應(yīng)面分析因素水平表Table 2 Levels and factors of the response surface analysis

表3 不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響Table 3 The influence of different carbon sources on fermentation level of Bacillus coagulans

2.1.3 不同碳氮比對(duì)發(fā)酵水平的影響 由表5可知，碳氮比為1∶2、1∶1和1∶3時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌菌體數(shù)較高，分別為40.6×108CFU/mL、38.3×108CFU/mL和37.2×108CFU/mL，且各不同碳氮比處理芽孢率基本相同，因此，選擇1∶2為凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵最佳碳氮比。

表4 不同氮源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響Table 4 The influence of different nitrogen sources on fermentation level of Bacillus coagulans

表5 不同碳氮比對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響Table 5 The influence of different carbon nitrogen ratio on fermentation level of Bacillus coagulans

2.1.4 不同比例復(fù)合氮源對(duì)發(fā)酵水平的影響 由表6知，復(fù)合氮源大豆粉和魚粉質(zhì)量比為2∶1和1∶1時(shí)，菌體數(shù)和芽孢數(shù)較高，菌體數(shù)分別為37.5×108CFU/mL和35.4×108CFU/mL，芽孢數(shù)分別為24.0×108CFU/mL和22.7×108CFU/mL，由各處理芽孢率差異不大，故選擇2∶1為凝結(jié)芽孢桿菌液體發(fā)酵復(fù)合氮源大豆粉和魚粉的最佳質(zhì)量比。

2.1.5 無機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵水平的影響 由表7可知，添加磷酸氫二鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鈉和硝酸鈉時(shí)，菌體數(shù)分別為21.5×108、15.6×108、15.2×108、14.1×108CFU/mL，均高于對(duì)照菌體數(shù)10.6×108CFU/mL；從芽孢數(shù)看，添加磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、硫酸鎂和硫酸錳時(shí)，與對(duì)照相比，芽孢數(shù)均有不同程度提高。

表6 不同比例復(fù)合氮源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響Table 6 The influence of composite carbon sources of different proportions on fermentation level of Bacillus coagulans

表7 不同無機(jī)鹽對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢形成率的影響結(jié)果Table 7 The influence of different inorganic salts on fermentation level of Bacillus coagulans

2.2 影響凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的重要因素篩選

P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表8。運(yùn)行Minitab軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行各因素效應(yīng)計(jì)算及重要性評(píng)價(jià)，結(jié)果見表9。淀粉、魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀三個(gè)因素效應(yīng)值的絕對(duì)值較大，絕對(duì)值越大，該因素對(duì)菌體數(shù)影響越大。從P值看，淀粉、魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀三個(gè)因素置信度均高于95%，其P值分別為0.025、0.037和0.047，其它因素在α=0.05水平上對(duì)菌體數(shù)影響不顯著，因此，將淀粉、魚粉+大豆粉和磷酸氫二鉀三因素作為重要因素，進(jìn)一步采用響應(yīng)面進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

表8 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 The design matrix and experimental results of Plackett-Burman design and test

注：“-1，0和1”分別表示培養(yǎng)基顯著因素“低、中和高”濃度水平。下同。

Note:“-1,0 and 1”indicates respectively“l(fā)ow,medium and high”concentration level of each significant factor of culture medium.The same below.

表9 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平的選擇及重要性評(píng)價(jià)Table 9 The selection of factor and level and importance evaluation of Plackett-Burman test

注：同列肩標(biāo)“*”表示顯著(P<0.05)，“**”表示極顯著(P<0.01)。

Note:Values with superscript“*”in the same column indicate significant difference(P<0.05)，those with“**”indicate extreme difference(P<0.01).

2.3 最陡爬坡路徑逼近響應(yīng)區(qū)試驗(yàn)

將P-B試驗(yàn)選取的三個(gè)重要因素淀粉、魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。用Minitab軟件對(duì)P-B試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到一次回歸方程：菌體數(shù)=24.9+5.67A-4.70B+2.33C-5.03D+1.83E+3.07F，根據(jù)P-B試驗(yàn)得出的上述一次擬合方程安排最陡爬坡試驗(yàn)。一次擬合方程中各變量的系數(shù)決定爬坡方向和變化步長(zhǎng)，如果系數(shù)為負(fù)，則該因素水平應(yīng)為遞減，反之遞增，系數(shù)越大變化越小。

顯著因素的變化方向、步長(zhǎng)和試驗(yàn)結(jié)果見表10。從表10可知，第4組試驗(yàn)淀粉11.0 g/L、大豆粉+魚粉20.0 g/L和磷酸氫二鉀2.6.0 g/L時(shí)凝結(jié)芽孢桿菌液體發(fā)酵菌體數(shù)最高，為54×108CFU/mL。故采用淀粉11.0 g/L、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比=2∶1)20.0 g/L和磷酸氫二鉀 2.6 g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表10 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 10 The design and results of steepest climbing test

2.4 響應(yīng)面分析法確定最大響應(yīng)值

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表11，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Minitab分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)回歸分析，結(jié)果見表12。經(jīng)擬合得到二次回歸數(shù)學(xué)模型，R=57.4667+2.300A+1.675B+1.8C-5.74583A2-3.94583B2-2.54583C2+1.175AB-1.675AC-0.875BC回歸模型失擬項(xiàng)P=0.251，失擬不顯著。模型相關(guān)系數(shù)R =0.981，調(diào)整后R =09468，說明模型擬合較好。從響應(yīng)面分析三維圖可以看出淀粉、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀3個(gè)因素對(duì)菌體數(shù)的影響，如圖1～3。

表11 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 11 The design and results of response surface test

對(duì)回歸方程各自變量(A、B、C)分別求一階偏導(dǎo)數(shù)，并均令其為0，即可得到三元一次線性方程組，求解即得極值點(diǎn)：A=0.2057，B=0.2309，C=0.3038，對(duì)應(yīng)淀粉為10.6 g/L、大豆粉為13.5 g/L、魚粉為6.7 g/L、磷酸氫二鉀為2.72 g/L，預(yù)測(cè)響應(yīng)最大值為63.2357。

試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基組成為淀粉 10.6 g/L、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比=2∶1)20.2 g/L、磷酸氫二鉀 2.72 g/L、其它無機(jī)鹽(磷酸二氫鈉0.312 g/L、碳酸鈣0.2 g/L、一水硫酸錳 0.234 g/L、硝酸鈉 0.34 g/L和七水硫酸鎂 0.74 g/L)。在此最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)67×108CFU/mL。

表12 回歸模型及方差分析結(jié)果Table 12 The result of regression model and analysis of variance

3 討 論

凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽添加劑方面的應(yīng)用報(bào)道日益增多，但有關(guān)其產(chǎn)業(yè)化方面的報(bào)道相對(duì)較少，分析其原因，主要是凝結(jié)芽孢桿菌在產(chǎn)業(yè)化過程中存在兩個(gè)關(guān)鍵限制因素，低菌體量和低芽孢率，解決辦法主要集中在菌體量發(fā)酵優(yōu)化[8-13]，而結(jié)合提升芽孢率的菌體量發(fā)酵優(yōu)化亟待解決。鑒于此，本研究通過單因素試驗(yàn)，兼顧菌體數(shù)和芽孢率，對(duì)碳氮源、碳氮比和無機(jī)鹽進(jìn)行篩選，一方面為解決產(chǎn)業(yè)化過程的瓶頸，另一方面為進(jìn)一步的響應(yīng)面試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

在P-B試驗(yàn)結(jié)果分析表明，淀粉、魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀三因素效應(yīng)值分別為11.333、-9.400和-10.067，置信度均高于95%，P值分別為0.025、0.037和0.047，是顯著影響凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的重要因素。淀粉成為顯著影響發(fā)酵因素，分析其原因可能與碳源淀粉酶降解轉(zhuǎn)化成葡萄糖，為細(xì)菌生命活動(dòng)提供能量和合成細(xì)胞骨架物質(zhì)等有關(guān)，這與該凝結(jié)芽孢桿菌菌株產(chǎn)淀粉酶活力強(qiáng)一致。魚粉和大豆粉成為顯著性因素，主要原因可能是氮源被分解為各種氨基酸，能夠重新用來合成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸等重要生命物質(zhì)。劉馨磊等[11]和陳秋紅等[12]對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵優(yōu)化的研究表明，磷酸氫二鉀在發(fā)酵培養(yǎng)中有重要作用。而本研究中，無機(jī)鹽磷酸氫二鉀成為顯著影響發(fā)酵因素，可能是其間接參與了細(xì)胞相關(guān)代謝。

單從P-B試驗(yàn)淀粉因素看，高水平各處理平均菌體數(shù)為30.53×108CFU/mL，而低水平各處理平均菌體數(shù)為19.20×108CFU/mL，因此，應(yīng)選擇高水平濃度12.5 g/L；單從P-B試驗(yàn)魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)因素看，高水平各處理平均菌體數(shù)為20.17×108CFU/mL，而低水平各處理平均菌體數(shù)為29.57×108CFU/mL，因此，應(yīng)選擇低水平濃度15.0 g/L；單從P-B試驗(yàn)磷酸氫二鉀因素看，高水平各處理平均菌體數(shù)為19.83×108CFU/mL，而低水平各處理平均菌體數(shù)為29.90×108CFU/mL，因此，應(yīng)選擇低水平濃度1.7 g/L。最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果中心點(diǎn)為淀粉11.0 g/L、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比=2∶1)20.0 g/L和磷酸氫二鉀2.6 g/L。各因素水平并不完全一致，說明各因素間有一定的交互影響作用，而最陡爬坡試驗(yàn)則消除了該種交互影響作用，并為進(jìn)一步響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)回歸分析擬合，得到二次回歸數(shù)學(xué)模型，經(jīng)求解得到極值點(diǎn)，對(duì)應(yīng)最佳培養(yǎng)基組成：淀粉為10.6 g/L、大豆粉為13.5 g/L、魚粉為6.7 g/L、磷酸氫二鉀為2.72 g/L，液體發(fā)酵活菌數(shù)達(dá)67×108CFU/mL，發(fā)酵水平較優(yōu)化前提高50×108CFU/mL。目前，國(guó)內(nèi)多家單位采用正交試驗(yàn)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵優(yōu)化進(jìn)行研究，秦艷等[6]報(bào)道凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平為7.0×108CFU/mL；劉馨磊[11]等通過流加補(bǔ)料，菌體數(shù)達(dá)4.5×109CFU/mL，芽孢數(shù)達(dá)1.2×109CFU/mL；陳秋紅等[12]報(bào)道凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平達(dá)6.0×109CFU/mL；崔東良等[13]通過對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究，菌體數(shù)達(dá)9.3×109CFU/mL。然而通過正交試驗(yàn)獲得的優(yōu)選值不會(huì)超越所取水平范圍，也不能給進(jìn)一步試驗(yàn)提供明確指向性，而通過P-B試驗(yàn)可快速篩選出重要響應(yīng)因素，為最陡爬坡試驗(yàn)指明方向及變化步長(zhǎng)，并逼近最大響應(yīng)區(qū)域，通過中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析得到擬合模型方程，進(jìn)而獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分濃度，因此，響應(yīng)面法優(yōu)化更加具有科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

通過響應(yīng)面法獲得凝結(jié)芽孢桿菌最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：淀粉 10.6 g/L、大豆粉 13.5 g/L、魚粉 6.7 g/L、磷酸氫二鉀 2.72 g/L、磷酸二氫鈉0.312 g/L、碳酸鈣0.2 g/L、一水硫酸錳 0.234 g/L、硝酸鈉 0.34 g/L和七水硫酸鎂 0.74 g/L。在此最佳發(fā)酵培養(yǎng)基下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液菌體數(shù)達(dá)67×108CFU/mL。參考以上國(guó)內(nèi)研究的發(fā)酵水平數(shù)據(jù)，該試驗(yàn)菌株的發(fā)酵水平還有一定提升空間，另一方面也為其進(jìn)一步發(fā)酵罐放大和中試轉(zhuǎn)化提供了理論依據(jù)。

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