PRRS流行毒株與減毒活疫苗TJM-F92株qPCR區(qū)分方法的建立與應用

劉月月，陶海英，杜以軍，2，王興東，于江，2，趙鵬偉，2，劉思當，王金寶*，吳家強，2*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100；3. 山東農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山東 泰安 271018；4.山東省壽光圣城街道畜牧獸醫(yī)管理站，山東 濰坊 262700)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗稱豬藍耳病，自2006年發(fā)生由變異毒株引起的高致病性藍耳病以來，高致病性藍耳病病毒已經(jīng)成為我國豬場流行的優(yōu)勢毒株，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。近年來，人們一直致力于豬藍耳病的免疫學研究，由于最早研發(fā)的豬藍耳病滅活苗不能有效遏制該病的發(fā)生流行，豬藍耳病經(jīng)典毒株弱毒苗、變異毒株致弱苗被廣泛使用[2]。但是，活疫苗的返強、變異、免疫抑制、對其它疫苗的干擾等問題正逐漸顯現(xiàn)。

雖然如此，武華等[3]發(fā)現(xiàn)的豬繁殖與呼吸綜合征TJM-F92減毒活疫苗，經(jīng)大量臨床驗證該疫苗能夠提升機體的細胞免疫，對防治PRRSV的感染具有良好的效果。目前，實驗室檢測PRRSV常用的ELISA方法不能有效的區(qū)別流行毒株與疫苗毒株[4]。梅林等[5]設計的普通PCR能夠很好的區(qū)分野毒株與疫苗株，但比較費時，且不能對病毒含量進行定量檢測。而熒光定量PCR不僅具有操作簡便、敏感性高、特異性強、重復性好等優(yōu)點，而且能夠?qū)Ω咧虏⌒远局甑暮窟M行定量分析，可以在疾病早期對PRRSV做出診斷[6-7]。

本研究根據(jù)TJM-F92減毒活疫苗與流行毒株Nsp2基因的缺失部位不同，選取Nsp2作為目的片段，旨在建立一步法SYBR Green I qPCR，以期實現(xiàn)對PRRSV流行毒與疫苗毒的鑒別，并為PRRSV隱形感染或者早期診斷提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 毒 株

PRRSV SX-1分離株、豬乙腦病毒(JEV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等均由本實驗室保存，PRRSV TJM-92株減毒活疫苗購自青島易邦生物工程有限公司。

1.2 引物設計

根據(jù)GenBank中發(fā)表的PRRSV SX-1(GQ857656)和PRRSV TJM-F92[8]中Nsp2缺失堿基部位的不同，利用Premier 5.0軟件設計引物，擴增產(chǎn)物長度為131 bp，由上海生物工程技術服務有限公司合成。PRRSV(F1):5'- ACCAGGCGTTTCGCATCT-3'；PRRSV(R1): 5'-ACTCTCTGCACTCACGGAAGG-3'；PRRSV(F1 T7): 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGAACCAGGCGTTTCGCATCT-3'。

1.3 病毒RNA 的提取和體外轉(zhuǎn)錄模板的制備

用TRIzol(Invitrogen公司)法提取PRRSV SX-1的RNA。以提取的RNA 為模板, 選用引物F1 T7、R1 經(jīng)一步法RT-PCR(大連寶生物工程有限公司) 擴增得到的目的條帶作為體外轉(zhuǎn)錄模板。RT-PCR 擴增體系為50 μL:PrimenScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL;2×1 Step Buffer 25 μL;引物F1T7、R1(10 μM)各1 μL;模板3 μL;RNase Free dH2O 18μL。反應條件為:50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄30 min; 95 ℃ 預變性2 min; 94 ℃變性1 min, 55 ℃退火30 s, 72 ℃ 延伸1 min, 共32個循環(huán); 72 ℃ 延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 凝膠成像系統(tǒng)(美國Alphalmager EC型)觀察結果,并用紫外分光光度計(Thermo公司)測其濃度，同時將PCR產(chǎn)物送至上海生物工程技術服務有限公司測序，以確認T7啟動子序列是否成功連入目的片段中。

1.4 RNA 標準品的合成

按體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明書要求，取1 μL PCR 產(chǎn)物用T7 RNA 聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄, 產(chǎn)物最終溶解于DEPC 水中, 并用紫外分光光度計測其濃度。通過公式將得到的RNA 換算為拷貝/μL, 用RNase Free Water 進行10 倍稀釋, 作為標準品, -80 ℃保存。

1.5 熒光定量PCR檢測PRRSV

對熒光定量PCR的引物濃度、退火溫度、反應時間等條件探索，以得到最佳的qPCR反應條件。

1.6 標準曲線的建立

按上述優(yōu)化的條件，選擇109、 108、107、106、105、104拷貝/μL 6個濃度梯度的RNA標準品作為模板，每個共做3個重復進行擴增，得到各自的動力學曲線，儀器軟件自動生成標準曲線(Roche480Ⅱ熒光定量PCR儀購自德國羅氏公司)。

1.7 敏感性試驗

本試驗分別以109、 108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL的標準品作為模板，進行qPCR和常規(guī)RT-PCR檢測，比較兩種檢測方法的敏感性。

1.8 特異性試驗

以PRRSV TJM-F92株弱毒疫苗、豬乙腦病毒(JEV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)提取的RNA為模板進行熒光定量RT-PCR檢測，以確定該方法的特異性。

1.9 RNA標準品的穩(wěn)定性試驗

取不同稀釋度的RNA標準品，分別在第1、15、30 d進行qPCR檢測，每個稀釋度3個重復，以Ct值的變化作為評價其穩(wěn)定性的指標。

1.10 臨床樣品檢測

對送檢的218份病料和血清(其中86份免疫過PRRSV TJM-F92株弱毒疫苗)進行常規(guī)RT-PCR和qPCR檢測并比較。

2 結果與分析

2.1 擴增片段大小的鑒定

用引物F1T7、R1對提取的RNA模板進行qPCR擴增，取10 μL產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，擴增出的帶T7啟動子的目的片段約131 bp, 與預期片段大小相符(圖1)。測序結果顯示T7啟動子已成功連入擴增產(chǎn)物，可以在T7聚合酶的作用下進行體外轉(zhuǎn)錄，得到單鏈RNA。

2.2 RNA標準品的制備

體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA經(jīng)紫外分光光度計測定其濃度為384.5 ng/μL。根據(jù)公式將標準品濃度換算為拷貝/μL，并按比例稀釋成1010～101拷貝/μL，- 80℃保存。

圖1 qPCR擴增目的條帶 Fig.1 qPCR amplification of target gene M.DL 2 000 DNA Marker ；1.qPCR擴增產(chǎn)物M. DL 2 000 DNA Marker；1. amplification product of qPCR

2.3 熒光定量PCR檢測PRRSV方法優(yōu)化

優(yōu)化后的PCR反應體系為25 μL，其中2×One Step SYBR qPCR Buffer 12.5 μL；PrimScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL；F1、R1引物(10 μM)各1 μL；Rnase Free dH2O 7.5 μL;總RNA 2 μL。熒光定量PCR反應條件為：42 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min;95 ℃ 預變性3 min; 94 ℃10 s,55 ℃ 10 s, 進行40 個循環(huán)的擴增, 每個循環(huán)收集熒光信號。

2.4 標準曲線的建立

按上述優(yōu)化條件，選擇109、 108、107、106、105、104拷貝/μL 共6個梯度濃度的RNA標準品作為模板進行擴增，熒光定量PCR儀自動生成制作動力學曲線(圖2)和標準曲線(圖3)。結果顯示各個稀釋度之間具有良好的重復性，且標準曲線的線性方程為Y=-3.259X+38.55，決定系數(shù)R2=0.998。

循環(huán)數(shù)Cycle numbers

圖3 熒光定量RT-PCR標準曲線Fig.3 Standard curve of fluorescent quantitative RT-PCR

2.5 敏感性試驗

熒光定量PCR能檢測出的模板最低濃度為1.0×101拷貝/μL (圖4)，而常規(guī)PCR能檢出最低模板濃度為1.0×103拷貝/μL (圖5)，表明熒光定量PCR的敏感性比常規(guī)PCR高100倍。

循環(huán)數(shù)Cycle numbers

2.6 特異性試驗

采用1.0×107拷貝/μL的RNA標準品作為陽性對照，同時以提取的PRRSV TJM-92、JEV、CSFV、PEDV、TGEV的RNA作為檢測對象,進行一步法SYBR GreenI qPCR，結果表明35個循環(huán)內(nèi)除陽性對照外，其余樣品這些病毒的擴增曲線基本為水平線未出現(xiàn)有效的擴增信號。表明該方法有很好的特異性(圖6)，并能夠準確的區(qū)分PRRSV 弱毒疫苗和野毒感染。

2.7 RNA標準品穩(wěn)定性試驗

RNA標準品在-80 ℃下有較好穩(wěn)定性，不同濃度RNA標準品在不同時間測得的Ct值見表1。

由表1可知，不同濃度的RNA標準品變異系數(shù)均小于2%，說明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

表1 穩(wěn)定性試驗結果Table 1 Results of stability tests

2.8 臨床樣品的檢測

對送檢疑似藍耳病的218份病料和血清(其中86份免疫過PRRSV減毒活疫苗 TJM-F92株)進行常規(guī)RT-PCR和qPCR檢測并對比。試驗結果如表2所示，免疫過TJM-F92株弱毒疫苗的豬群發(fā)病率明顯低于未免疫或者免疫其他毒株疫苗的豬群，且qPCR檢出率高于常規(guī)RT-PCR。

表2 臨床樣品檢測結果Table 2 Results of clinical samples detection

3 討 論

目前，高致病豬藍耳病病毒已成為優(yōu)勢流行毒株。PRRSV的基因組全長約15 kb，含有九個開放閱讀框(ORFs)，其中以Nsp2的變異最大[9]。不同PRRSV間存在著長度不一的缺失，因而對Nsp2的分析在一定程度上可以反映病毒基因組序列的變異情況[10]。而我國流行的高致病性藍耳病病毒在Nsp2基因的482和534～562位缺失了1個和29個氨基酸，TJM-F92減毒活疫苗又在原缺失的基礎上缺失了120個氨基酸，這為鑒別診斷提供依據(jù)。

本研究在缺失序列處設計了一對引物，特異性試驗也證實了該引物的高度特異性，可滿足PRRS流行毒株檢測要求。標準品是熒光定量 PCR 分析方法中最為重要的因素[11]。在研究PRRSV的熒光定量PCR試驗時將目的片段克隆至T載體, 以鑒定正確的質(zhì)粒為模板進行轉(zhuǎn)錄[12-13]，而本試驗選用RNA為模板制作標準曲線，通過在上游引物的5，端加入T7啟動子序列，擴增的目的片段可以直接用T7 RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄而獲得，避免了以質(zhì)粒為模板制備標準品過程中的連接轉(zhuǎn)化、鑒定等步驟，大大簡化了試驗步驟。試驗結果表明RNA標準品穩(wěn)定性好, -80 ℃保存30 d無顯著變化。

針對國內(nèi)流行的高致病性PRRSV變異株基因組的特點，國內(nèi)學者建立了高致病性PRRSV RT-PCR檢測技術[14-15]。本研究采用的一步法SYBR Green I qPCR可在同一反應管中連續(xù)進行擴增和檢測，只需要1 h的時間即可完成檢測，較普通PCR反應時間縮短2 h，并且不需要普通PCR后的電泳處理，能有效防止污染，避免了假陽性結果的出現(xiàn)[16-17]，另外熒光PCR儀能夠在整個過程中自動記錄讀數(shù)并對擴增產(chǎn)物進行精確定量。靈敏性也比普通RT-PCR高出100倍；對臨床送檢樣品的檢測結果也顯示qPCR的檢出率比常規(guī)RT-PCR高出12.9個百分點。同時該方法實現(xiàn)了對流行毒株含量的定量檢測。通過上述結果均顯示了本試驗方法可以很好地用于豬繁殖與呼吸綜合征高致病性流行毒株與弱毒疫苗TJM-F92株的鑒別診斷,從而對PRRS做出及時的診斷。

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