紅景天多糖對幼鼠精原干細(xì)胞體外增殖的影響*

余冬冬，耿果霞，張成娟，劉亞偉，胡靚華，曹華琳，李青旺*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.山東省安丘市人民醫(yī)院，山東 安丘 052164)

精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是指位于雄性哺乳動(dòng)物睪丸的曲細(xì)精管生精上皮基膜內(nèi)側(cè)的一群具有高度自我更新能力和分化潛能的細(xì)胞，在哺乳動(dòng)物中一般是指未分化的A型精原細(xì)胞[1]。作為一類原始的精原細(xì)胞，SSCs既能自我更新生成新的干細(xì)胞從而維持自身群體穩(wěn)定，又能定向分化形成各階段的生殖細(xì)胞，并能最終分化形成精子[2]。SSCs通過分化成精子而能向子代傳遞遺傳信息，在雄性動(dòng)物的精子發(fā)生過程中，SSCs的地位極其重要，SSCs是體內(nèi)唯一的，能在細(xì)胞水平進(jìn)行識別并研究其增殖、分化及調(diào)控的一種成體干細(xì)胞[3]。由于SSCs獨(dú)具的生物學(xué)特性，對于干細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域均具有重要的理論和實(shí)踐意義。

紅景天多糖(Rhodiola Sachalinensis polysaccharides,RSP)為景天科景天屬(Rhodiola)植物的干燥根及莖的多糖提取物，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖與半乳糖醛酸組成的多糖[4]。近代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖具有抗疲勞、抗寒、抗氧化、抗衰老、耐缺氧、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血糖和抗細(xì)胞凋亡等多種生物活性，成為近年研究開發(fā)的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖對體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用[5]。雖然如此，但關(guān)于紅景天多糖對于SSCs體外培養(yǎng)的作用未見相關(guān)報(bào)道。試驗(yàn)通過Sertoli細(xì)胞與SSCs細(xì)胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中加入紅景天多糖，對比了不同濃度的紅景天多糖的作用，以堿性磷酸酶(AP)和RT-PCR為鑒定依據(jù)，探討紅景天多糖對SSCs體外增殖的影響，探尋促進(jìn)SSCs體外增殖的方法，以期為促進(jìn)SSCs體外培養(yǎng)提供一些參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本研究小鼠為出生后6～8 d的健康、清潔級雄性昆白小鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 紅景天多糖的提取 參考張樹山等[6]介紹的方法，將紅景天粉碎后置于80 ℃蒸餾水浸泡5 h后取其上清液，然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，凍干處理經(jīng)粉碎后所獲得粉末即為紅景天多糖，將其密封后置于室溫保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SSCs的分離和純化 每次試驗(yàn)分別取仔鼠4 ～10只，脫頸處死后，無菌取出睪丸。去除附睪、白膜等，將暴露出來的曲細(xì)精管切成小段，并反復(fù)吹打。先用10倍體積于組織塊的Ⅳ型膠原酶(1 mg/mL)和少量DNaseⅠ(1 mg/mL)消化30 min，以除去間質(zhì)細(xì)胞和一些血管成分，消化期間每隔5 min搖動(dòng)一次。 再加入10倍體積的胰蛋白酶(0.25%)消化5 min，期間不斷吹打，然后用含10% 胎牛血清的等量DMEM終止消化。接著將細(xì)胞懸液移入離心管中以800 r/min 離心5 min，將收集后的細(xì)胞接種于含10 % 胎牛血清的DMEM(預(yù)先加入100 U/mL的青霉素、鏈霉素)培養(yǎng)皿內(nèi)，未消化的組織成分用400目的細(xì)胞篩過濾除去，隨后于37 ℃、5 % CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。根據(jù)SSCs和Sertoli細(xì)胞貼壁速度的不同進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

1.2.2 Sertoli細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備 根據(jù)貼壁速度不同，將體外培養(yǎng)4 h后的未貼壁的精原細(xì)胞吸去，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。選擇生長較密集的Sertoli細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄去原培養(yǎng)液，用10 μg/L的絲裂霉素C處理細(xì)胞4 h后，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，重新加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后即可作為飼養(yǎng)層。

1.2.3 SSCs共培養(yǎng) 將分離獲得的SSCs以約 1×105/cm2接種在預(yù)先制備好的Sertoli飼養(yǎng)層細(xì)胞上，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液+100 U/mL青霉素和鏈霉素+1% 谷氨酰胺+1% 非必需氨基酸+1% 丙酮酸鈉+體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清，再在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別加入0、100、200、300和400 ng/mL 紅景天多糖，以不加入紅景天多糖組為對照，每個(gè)處理有三個(gè)重復(fù)組，每隔48 h 觀察細(xì)胞形態(tài)并檢測其增殖狀況。

SSCs增殖情況檢測時(shí)，將SSCs在37 ℃ 用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)處理4 h，除去上清液，加入DMSO后置搖床上振蕩20 min，以充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚，用酶標(biāo)儀于490 nm 處測量各孔的吸光值(OD490)。

1.2.4 SSCs的鑒定

1.2.4.1 堿性磷酸酶(AP)染色檢測 將待染色的SSCs用PBS洗2次，加入4% 多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗2次，25 mL Tris-HCl(pH 9.0)漂洗1次，然后用NBT/BCIP AP顯色試劑盒染色，避光孵化15～30 min后，PBS漂洗終止反應(yīng)，400倍倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4.2 RT-PCR檢測標(biāo)記基因 取培養(yǎng)1周左右的SSCs，使用RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，兩步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s變性，58 ℃ 40 s退火，72 ℃ 1 min延伸，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min終末延伸，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照，對獲得的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 % 瓊脂糖電泳檢測，相關(guān)基因的引物序列見表1。

1.3 數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素ANOVA方差分析，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼鼠SSCs的形態(tài)

體外培養(yǎng)1周后，添加紅景天多糖組均較對照組SSCs明顯增加，其中添加量為300 ng/mL 的細(xì)胞生長最好。培養(yǎng)1周后的細(xì)胞形成了克隆團(tuán)，且AP染色呈紅棕色(見圖1)。

表1 相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primers designed for related genes

2.2 幼鼠SSCs的RT-PCR鑒定

標(biāo)記基因的檢測見圖2。由圖2可知，463 bp的β-actin 基因、395 bp 的GFRa-1基因以及369 bp的Thy-1基因均在目的細(xì)胞中表達(dá)，表明試驗(yàn)分離獲得的細(xì)胞為SSCs。

2.3 紅景天多糖對SSCs的增殖作用

精原干細(xì)胞增殖的MTT檢測見圖3。如圖3所示，培養(yǎng)至第2 d時(shí)，除添加量為100 ng/mL組外，其余試驗(yàn)組OD490較對照組均差異顯著(P<0.05)，各試驗(yàn)組間差異顯著(P<0.05)；而培養(yǎng)至第4 d時(shí)，試驗(yàn)組與對照組OD490均差異顯著(P<0.05)，添加400 ng/mL組與100 ng/mL和200 ng/mL組間差異不顯著(P>0.05)，而其余組間均差異顯著(P<0.05)，增殖率最高可達(dá)152%。

圖1 小鼠精原干細(xì)胞的AP染色(400×)Fig.1 AP staining for mouse spematogonial stem cells(400×)

圖2 標(biāo)記基因的檢測Fig.2 Identification of mouse SSCs with marker genes

圖3 精原干細(xì)胞增殖的MTT檢測Fig.3 MTT test for the proliferation of spermatogonial stem cells

3 討 論

紅景天為景天科景天屬(Rhodiola)多種植物的干燥根及莖，具有抗疲勞、抗寒、抗衰老、抗微波輻射、耐缺氧、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血糖等多種功能，作為傳統(tǒng)藥材已有千年歷史[7]。過去對其有效成分的研究集中在紅景天苷、紅景天素和酪醇上，隨著研究的深入，紅景天多糖因其獨(dú)特的生理活性和藥理作用而受到關(guān)注。紅景天多糖為紅景天干燥根及莖的多糖提取物，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和半乳糖等組成。紅景天多糖作為傳統(tǒng)的中草藥提取物，具有抗衰老、抗氧化以及抗凋亡等多種生物活性。紅景天多糖對小鼠心肌細(xì)胞有較強(qiáng)的保護(hù)作用，能夠增強(qiáng)血液中的SOD活性[8]，并能增強(qiáng)四氧嘧啶和腎上腺素引起的肝糖原分解[9]，且具有明顯的抗傷害感受作用[10]。在生殖系統(tǒng)保護(hù)方面，紅景天多糖能提高豬精子的抗氧化能力，明顯提高豬冷凍精子品質(zhì)[11]。

AP是一種單酯磷酸水解酶，能在堿性條件下水解單酯釋放磷酸，AP通過磷脂酰肌醇聚糖聯(lián)接到細(xì)胞膜上定位在細(xì)胞表面，未分化細(xì)胞的AP表達(dá)量很高。作為成體干細(xì)胞的一種，SSCs分化程度很低，表現(xiàn)出較高的AP活性。大量研究表明，可借助細(xì)胞形態(tài)和AP活性可作為檢驗(yàn)SSCs的依據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明加入紅景天多糖后SSCs數(shù)量明顯增加，細(xì)胞為集落樣生長，并呈現(xiàn)出鏈狀或葡萄串狀生長的特點(diǎn)，AP染色結(jié)果符合SSCs的特征。

Thy-1、GFRa-1是目前體外鑒定SSCs常用的表面標(biāo)志物，而不存在于Sertoli細(xì)胞中，而β-actin是持家基因，在Sertoli細(xì)胞和SSCs中均表達(dá)。本試驗(yàn)通過檢測是否表達(dá)Thy-1、GFRa-1基因來鑒定細(xì)胞是否為SSCs，RT-PCR結(jié)果表明，Thy-1、GFRa-1基因均在所培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)，符合SSCs的基因特征，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為SSCs，這與李蓮軍等[12]的研究結(jié)果一致。

Kateri等[13]研究表明，決定干細(xì)胞的增殖和分化是由其內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制和外界與其緊密聯(lián)系的環(huán)境相互作用共同影響。Sertoli細(xì)胞作為SSCs的培養(yǎng)層，能夠提供一個(gè)與體內(nèi)SSCs增殖分化相類似的微環(huán)境，其分泌產(chǎn)生的GDNF能顯著地促進(jìn)SSCs的增殖。本試驗(yàn)中加入紅景天多糖后SSCs增殖明顯，增殖率可達(dá)152%。推測紅景天多糖可能在人為構(gòu)建的體外SSCs微環(huán)境中參與了Sertoli細(xì)胞對SSCs的免疫調(diào)節(jié)作用。另外，在獲得SSCs的過程中，由于機(jī)械力的剪切以及酶處理等作用，而隨后和飼養(yǎng)層細(xì)胞的共培養(yǎng)過程中各種成份的相互作用，SSCs可能會(huì)受到氧自由基的損傷。張奕等[14]研究證實(shí)，紅景天多糖具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基(O2-)和抑制脂質(zhì)過氧化作用的能力，推測紅景天多糖對SSCs的促增殖作用可能與其提高抗氧化能力及對機(jī)體的免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用相關(guān)，但其對精原干細(xì)胞增殖的作用機(jī)制以及高濃度對細(xì)胞增殖的抑制作用的機(jī)理仍待進(jìn)一步研究探討。而且由于紅景天多糖的組成成份復(fù)雜，究竟是其中某一個(gè)組分還是多個(gè)組分的相互作用而對精原干細(xì)胞的體外增殖產(chǎn)生影響，仍有待進(jìn)一步的研究。雖然本試驗(yàn)只是對SSCs的體外培養(yǎng)1周增殖的相關(guān)研究，但是SSCs的量顯著增加，為今后SSCs的研究及應(yīng)用提供新的思路和方法。

4 結(jié) 論

在以Sertoli細(xì)胞作為SSCs的培養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中，添加紅景天多糖能顯著增加體外培養(yǎng)的SSCs數(shù)量，且最適添加量為300 ng/mL。培養(yǎng)1周后的細(xì)胞為集落樣生長，并呈現(xiàn)出鏈狀或葡萄串狀生長的特點(diǎn)。紅景天多糖能顯著促進(jìn)以Sertoli細(xì)胞作為滋養(yǎng)層的體外培養(yǎng)體系中SSCs增殖，為后續(xù)SSCs的體外培養(yǎng)、研究應(yīng)用提供參考依據(jù)。

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