H9N2亞型豬流感病毒的增殖及毒力測定

魏 東

（河北北方學院動物科技學院，河北 張家口075000）

0 前 言

病毒缺乏增殖所需要的酶系統(tǒng)，只能在有感受性的活的宿主細胞內增殖，即以病毒基因為模板，進行自我復制。試驗所使用的豬流感病毒株經過－70℃低溫貯存，其毒力有較大差別，病毒有必要進行進一步培養(yǎng)，和增殖。雞胚接種法、動物接種法和組織培養(yǎng)法是目前常用的病毒培養(yǎng)方法。雞胚是正在發(fā)育的活體，病毒在雞胚中易于生長和增殖，多種病毒都能在雞胚中進行傳代[1]；而且SPF雞胚來源容易、無病毒的隱性感染、對培養(yǎng)條件無特殊要求，接種途徑和時間的可選性強、操作簡單，胚胎的組織分化程度低，沒有明顯的自身組織特征，病毒在雞胚中易于增殖，部分病毒感染雞胚以后可以產生痘斑，引起充血、出血、壞死灶和死亡等特異性感染指征。對于大多數(shù)病毒來說，雞胚接種法是最為常用的病毒培養(yǎng)方法，其中雞胚尿囊腔接種法是目前最常用的病毒增殖方式。本研究采用雞胚尿囊腔增殖法對試驗用H9N2－SIV毒株進行增殖，在病毒增殖后進一步測定其對雞胚和小鼠的毒力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和主要試劑

H9N2亞型豬流感病毒A／swine／HeBei／012／2008 （H9N2） （H9N2－SIV）由本課題組分離，經中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定，河北北方學院動物科技學院預防獸醫(yī)學實驗室保存。

其他試驗藥品均為分析純，試劑由課題組自配。

1.1.2 主要儀器設備

GRUMBACH孵蛋器，德國Grumbach公司；Heraeus Fresco 17離心機、超低溫冰箱、Thermo 1300series A2生物安全柜、微量加樣器，美國Thermo Scientific公司；電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；新型電熱恒溫鼓風干燥箱，寧波江南儀器廠；照蛋器，青島興儀電子設備有限公司；V形血凝板，上海基星生物科技有限公司。

1.1.3 實驗動物

6～8日齡SPF雞胚 （北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司）[SCXK （京）2009－0003]，于接種前進行孵化至10日齡；

8周齡SPF級BALB／c雌性小鼠 （北京華阜康生物科技股份有限公司）[SCXK （京）2009－0004]；

動物試驗在中國人民解放軍251醫(yī)院三級生物安全實驗室 （BSL－3，P3）進行 [SYXK （軍）2007－018]，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 方法

1.2.1 H9N2－SIV的增殖及血凝效價測定

將病毒原液作10倍稀釋，采用雞胚尿囊腔接種法[2]將H9N2－SIV病毒接種于10日齡雞胚，收取尿囊液進行血凝試驗。

1.2.1.1 H9N2－SIV的增殖－雞胚尿囊腔接種法

（1）驗蛋，判斷活胚或死胚。取10日齡的SPF雞胚30只，先檢查雞胚外觀，有裂痕、發(fā)育不全或有其它問題的雞胚應棄掉不用。然后用照蛋器檢測，根據(jù)正常雞胚標準對雞胚進行判別，對于不符合要求的死胚、無受精胚等棄掉不用。對于可用雞胚，標記雞胚的尿囊與氣室的界限和胚胎位置，并在氣室端、雞頭方的雞胚尿囊膜邊緣上方0.5cm處避開血管作一標記 （注射點）。

表1 雞胚標準

（2）消毒。取干凈已消毒蛋盤，將雞胚氣室朝上豎放于蛋盤上，在氣室部和標記處先后用碘酊和酒精消毒蛋殼表面，用打孔器在標記處鉆一小孔。

（3）接種。取l mL注射器吸取病毒液，由鉆孔處垂直進針，經絨毛尿囊膜注入0.1mL病毒液到尿囊腔中。

（4）封孔。接種前先將石蠟融化，待接種后立即用石蠟將蛋殼上的針孔完全封閉，并做標記。

（5）孵育。將接種后的雞胚放入37℃溫箱中孵育48～72h（相對濕度為45%～60%），接種后24h照胚，將24h內死亡的雞胚棄去 （因機械操作、細菌或霉菌污染等非特性因素所引起，認為是非特異死亡），以后每4～6h照胚檢查1次，隨時取出死亡雞胚，放入2～8℃冷胚。

（6）冷胚。雞胚在收獲前置4℃冰箱6h或過夜 （使血液凝固，以免收獲時流出紅細胞，并同尿囊液的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度下降，但不能放置時間過長；如急于收胚也可將雞胚置于－20℃、1h左右）。

（7）收胚。把冷卻好的雞胚氣室向上放在蛋盤上置于無菌室，將雞胚氣室部表面先后用碘酊和酒精消毒。先用無菌鑷子擊破氣室部卵殼并輕輕將蛋殼剝除，然后小心將氣室部殼膜從絨毛尿囊膜撕去，并將其翻開到卵殼邊上 （不要損傷絨毛尿囊膜），另換兩把無菌眼科鑷子在絨毛尿囊膜上撕開一小口，用一把眼科鑷子斜插入絨毛尿囊膜輕輕壓住胚胎，用滅菌注射器或移液器吸取尿囊液 （病毒液）于無菌EP管中（如操作時損傷了血管或胚胎，尿囊液混濁，則棄去不用），將尿囊收獲液 （病毒液）于3 000r·min－1離心5min去除里面的雜質[3]，標記后置低溫冰箱中保存待檢。

1.2.1.2 血凝 （HA）試驗測定病毒液效價

為使下一步的試驗順利進行，需要測定病毒與紅細胞的凝集價，以確定試驗所用病毒的稀釋倍數(shù) （抗原單位）。本試驗采用微量法，在V形血凝板上進行。

（1）取50μL的生理鹽水加入96孔V型血凝板A－H行的1～12孔；

（2）被檢病毒液50μL分別加入A－H行的第1孔，然后抽取50μL倍比稀釋至第11孔，棄去50μL，12孔不加作為陰性對照；

（3）從低濃度至高濃度，每孔加入50μL 1%雞紅細胞懸液 （采健康雄雞血液5～10mL于提前已加入4%枸椽酸鈉抗凝劑的大試管中，生理鹽水將血漿、白細胞等充分洗去，2 000r·min－1離心5～10min，共洗滌3～5次，最后將洗后的紅細胞用生理鹽水稀釋成1%的懸浮液，置4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（4）輕輕振蕩混勻、37℃靜置20min；

（5）觀察結果，根據(jù)發(fā)生凝集反應病毒的稀釋倍數(shù)確定HA滴度。

結果判定：將V形血凝板傾斜至45°，如果紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者，表明紅細胞與病毒沒有或不完全凝集；如果紅細胞平鋪于孔底，凝成均勻薄層，傾斜后也不流動，說明紅細胞被病毒凝集。

表2 血凝試驗方法 （μL）

1.2.2 雞胚半數(shù)感染量 （EID50）的測定

用滅菌生理鹽水將1.2.1所選擇的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋至10－10。然后通過尿囊腔途徑分別接種于10日齡雞胚尿囊腔，0.1mL／胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，石蠟封口，置37℃溫箱中孵育，具體操作方法同1.2.1，每12h觀察一次，24h之內死亡的雞胚棄掉，24h之后死亡的雞胚置4℃保存，連續(xù)觀察72h，收集尿囊液作血球凝集試驗，出現(xiàn)血凝者判陽性，采用Reed－Muench法[4]計算EID50。

1.2.3 小鼠半數(shù)致死量 （MLD50）測定

取8周齡SPF級BALB／c雌性小鼠30只，隨機分成6組作為H9N2－SIV感染組 （感染組），用滅菌生理鹽水將病毒液從100開始作10倍梯度稀釋至10－5，每個稀釋度分別經鼻腔滴鼻接種一組小鼠，接種劑量為0.1mL／只。另外取5只小鼠作為對照組，滴鼻接種0.1mL的經滅菌生理鹽水5倍稀釋的正常雞胚尿囊液。接種后于ABSL－3實驗室中正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14d，記錄各組小鼠的發(fā)病和死亡情況，按照Reed－Muench法[4]計算 MLD50。

Reed－Muench計算方法：

2 結果與分析

2.1 H9N2－SIV增殖及血凝效價測定

每枚雞胚可以收集約5mL左右尿囊液，大部分雞胚尿囊液血凝效價在1∶128～1∶1 024之間。為了避免實驗誤差和合理運用病毒液且不造成病毒液的浪費，取血凝效價在1∶128～1∶1 024之間的雞胚尿囊液混合，混合后測定雞胚尿囊液的血凝效價為1∶256，該病毒液 （混合雞胚尿囊液）確定為下一步試驗用病毒原液，分裝后貯存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 H9N2－SIV感染雞胚EID50測定

將血凝效價為1∶256的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋至10－10，分別接種雞胚，結果見表3，病毒的 EID50＝10－6.5·0.1mL－1。

表3 H9N2－SIV感染雞胚EID50測定結果

2.3 H9N2－SIV感染小鼠 MLD50測定

將血凝效價為1∶256的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋，經鼻腔滴鼻接種BALB／c小鼠，小鼠存活與死亡數(shù)目見表4。結果表明含病毒高的劑量 （低稀釋度）引起小鼠出現(xiàn)明顯的發(fā)病以及100%的死亡，隨著稀釋度的增加 （病毒含量降低），小鼠死亡相對減少，存活率增加，試驗小鼠50%出現(xiàn)死亡的病毒稀釋度在10－2～10－3之間，按照Reed－Muench法計算 MLD50，MLD50＝10－2.32·0.l mL－1，即能使50%小鼠死亡的病毒稀釋度為10－2.32。

表4 H9N2－SIV感染小鼠MLD50測定

3 討論和結論

為保證病毒在使用時效價最高、最穩(wěn)定，且不造成浪費，應確定病毒滴度，即病毒的毒力，也稱為毒價。衡量毒價的單位有最小致死量 （MLD）、最小感染量 （MID）和半數(shù)致死量 （LD50）等，但由于劑量的遞增與死亡率遞增不呈線性關系，在越接近100%死亡時，對劑量的遞增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%時，對劑量的變化越敏感，所以現(xiàn)多改用半數(shù)致死量 （LD50）作為毒價測定單位，即經規(guī)定的途徑，以不同的劑量接種試驗動物，在一定時間內能致半數(shù)試驗動物死亡的病毒量。應用半數(shù)致死量的方法有助于減少量度極端情況所帶來的問題和減少試驗的次數(shù)，節(jié)省時間和經費。然而，病毒對試驗動物的致病作用不一定都以死亡為標志，例如以感染發(fā)病作指標，則可以測定半數(shù)感染量 （ID50）；此外，當試驗材料是雞胚時則用雞胚半數(shù)致死量 （ELD50）或雞胚半數(shù)感染量 （EID50）表示；試驗材料是鼠類時則用鼠半數(shù)致死量 （MLD50）表示；試驗材料是細胞時則用組織細胞培養(yǎng)半數(shù)感染量 （TCID50）表示。

Reed－Muench法在病毒學研究中使用較多，適用于整體及離體實驗數(shù)據(jù)，但該方法報告的信息較少，結果不如正規(guī)概率單位計算法嚴謹，由于是用累積法計算，計算結果有一定的缺陷，誤差也較大。盡管如此，由于該方法計算簡單、使用方便，仍是目前計算LD50、ID50等數(shù)據(jù)最常用的方法。在實際操作中一般選擇10～100個 LD50作為病毒的接種濃度[5－9]。

試驗測定 H9N2－SIV經雞胚增殖后病毒液的血凝效價為1∶256，病毒的EID50為10－6.5·0.1mL－1，MLD50為10－2.32·0.1mL－1，該病毒可用于進一步的試驗。

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