H9N2亞型豬流感病毒的增殖及毒力測定

魏 東

（河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，河北 張家口075000）

0 前 言

病毒缺乏增殖所需要的酶系統(tǒng)，只能在有感受性的活的宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，即以病毒基因?yàn)槟０?，進(jìn)行自我復(fù)制。試驗(yàn)所使用的豬流感病毒株經(jīng)過－70℃低溫貯存，其毒力有較大差別，病毒有必要進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，和增殖。雞胚接種法、動物接種法和組織培養(yǎng)法是目前常用的病毒培養(yǎng)方法。雞胚是正在發(fā)育的活體，病毒在雞胚中易于生長和增殖，多種病毒都能在雞胚中進(jìn)行傳代[1]；而且SPF雞胚來源容易、無病毒的隱性感染、對培養(yǎng)條件無特殊要求，接種途徑和時(shí)間的可選性強(qiáng)、操作簡單，胚胎的組織分化程度低，沒有明顯的自身組織特征，病毒在雞胚中易于增殖，部分病毒感染雞胚以后可以產(chǎn)生痘斑，引起充血、出血、壞死灶和死亡等特異性感染指征。對于大多數(shù)病毒來說，雞胚接種法是最為常用的病毒培養(yǎng)方法，其中雞胚尿囊腔接種法是目前最常用的病毒增殖方式。本研究采用雞胚尿囊腔增殖法對試驗(yàn)用H9N2－SIV毒株進(jìn)行增殖，在病毒增殖后進(jìn)一步測定其對雞胚和小鼠的毒力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和主要試劑

H9N2亞型豬流感病毒A／swine／HeBei／012／2008 （H9N2） （H9N2－SIV）由本課題組分離，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定，河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

其他試驗(yàn)藥品均為分析純，試劑由課題組自配。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

GRUMBACH孵蛋器，德國Grumbach公司；Heraeus Fresco 17離心機(jī)、超低溫冰箱、Thermo 1300series A2生物安全柜、微量加樣器，美國Thermo Scientific公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，寧波江南儀器廠；照蛋器，青島興儀電子設(shè)備有限公司；V形血凝板，上?；巧锟萍加邢薰尽?/p>

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物

6～8日齡SPF雞胚 （北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司）[SCXK （京）2009－0003]，于接種前進(jìn)行孵化至10日齡；

8周齡SPF級BALB／c雌性小鼠 （北京華阜康生物科技股份有限公司）[SCXK （京）2009－0004]；

動物試驗(yàn)在中國人民解放軍251醫(yī)院三級生物安全實(shí)驗(yàn)室 （BSL－3，P3）進(jìn)行 [SYXK （軍）2007－018]，并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 方法

1.2.1 H9N2－SIV的增殖及血凝效價(jià)測定

將病毒原液作10倍稀釋，采用雞胚尿囊腔接種法[2]將H9N2－SIV病毒接種于10日齡雞胚，收取尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)。

1.2.1.1 H9N2－SIV的增殖－雞胚尿囊腔接種法

（1）驗(yàn)蛋，判斷活胚或死胚。取10日齡的SPF雞胚30只，先檢查雞胚外觀，有裂痕、發(fā)育不全或有其它問題的雞胚應(yīng)棄掉不用。然后用照蛋器檢測，根據(jù)正常雞胚標(biāo)準(zhǔn)對雞胚進(jìn)行判別，對于不符合要求的死胚、無受精胚等棄掉不用。對于可用雞胚，標(biāo)記雞胚的尿囊與氣室的界限和胚胎位置，并在氣室端、雞頭方的雞胚尿囊膜邊緣上方0.5cm處避開血管作一標(biāo)記 （注射點(diǎn)）。

表1 雞胚標(biāo)準(zhǔn)

（2）消毒。取干凈已消毒蛋盤，將雞胚氣室朝上豎放于蛋盤上，在氣室部和標(biāo)記處先后用碘酊和酒精消毒蛋殼表面，用打孔器在標(biāo)記處鉆一小孔。

（3）接種。取l mL注射器吸取病毒液，由鉆孔處垂直進(jìn)針，經(jīng)絨毛尿囊膜注入0.1mL病毒液到尿囊腔中。

（4）封孔。接種前先將石蠟融化，待接種后立即用石蠟將蛋殼上的針孔完全封閉，并做標(biāo)記。

（5）孵育。將接種后的雞胚放入37℃溫箱中孵育48～72h（相對濕度為45%～60%），接種后24h照胚，將24h內(nèi)死亡的雞胚棄去 （因機(jī)械操作、細(xì)菌或霉菌污染等非特性因素所引起，認(rèn)為是非特異死亡），以后每4～6h照胚檢查1次，隨時(shí)取出死亡雞胚，放入2～8℃冷胚。

（6）冷胚。雞胚在收獲前置4℃冰箱6h或過夜 （使血液凝固，以免收獲時(shí)流出紅細(xì)胞，并同尿囊液的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度下降，但不能放置時(shí)間過長；如急于收胚也可將雞胚置于－20℃、1h左右）。

（7）收胚。把冷卻好的雞胚氣室向上放在蛋盤上置于無菌室，將雞胚氣室部表面先后用碘酊和酒精消毒。先用無菌鑷子擊破氣室部卵殼并輕輕將蛋殼剝除，然后小心將氣室部殼膜從絨毛尿囊膜撕去，并將其翻開到卵殼邊上 （不要損傷絨毛尿囊膜），另換兩把無菌眼科鑷子在絨毛尿囊膜上撕開一小口，用一把眼科鑷子斜插入絨毛尿囊膜輕輕壓住胚胎，用滅菌注射器或移液器吸取尿囊液 （病毒液）于無菌EP管中（如操作時(shí)損傷了血管或胚胎，尿囊液混濁，則棄去不用），將尿囊收獲液 （病毒液）于3 000r·min－1離心5min去除里面的雜質(zhì)[3]，標(biāo)記后置低溫冰箱中保存待檢。

1.2.1.2 血凝 （HA）試驗(yàn)測定病毒液效價(jià)

為使下一步的試驗(yàn)順利進(jìn)行，需要測定病毒與紅細(xì)胞的凝集價(jià)，以確定試驗(yàn)所用病毒的稀釋倍數(shù) （抗原單位）。本試驗(yàn)采用微量法，在V形血凝板上進(jìn)行。

（1）取50μL的生理鹽水加入96孔V型血凝板A－H行的1～12孔；

（2）被檢病毒液50μL分別加入A－H行的第1孔，然后抽取50μL倍比稀釋至第11孔，棄去50μL，12孔不加作為陰性對照；

（3）從低濃度至高濃度，每孔加入50μL 1%雞紅細(xì)胞懸液 （采健康雄雞血液5～10mL于提前已加入4%枸椽酸鈉抗凝劑的大試管中，生理鹽水將血漿、白細(xì)胞等充分洗去，2 000r·min－1離心5～10min，共洗滌3～5次，最后將洗后的紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋成1%的懸浮液，置4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（4）輕輕振蕩混勻、37℃靜置20min；

（5）觀察結(jié)果，根據(jù)發(fā)生凝集反應(yīng)病毒的稀釋倍數(shù)確定HA滴度。

結(jié)果判定：將V形血凝板傾斜至45°，如果紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者，表明紅細(xì)胞與病毒沒有或不完全凝集；如果紅細(xì)胞平鋪于孔底，凝成均勻薄層，傾斜后也不流動，說明紅細(xì)胞被病毒凝集。

表2 血凝試驗(yàn)方法 （μL）

1.2.2 雞胚半數(shù)感染量 （EID50）的測定

用滅菌生理鹽水將1.2.1所選擇的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋至10－10。然后通過尿囊腔途徑分別接種于10日齡雞胚尿囊腔，0.1mL／胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，石蠟封口，置37℃溫箱中孵育，具體操作方法同1.2.1，每12h觀察一次，24h之內(nèi)死亡的雞胚棄掉，24h之后死亡的雞胚置4℃保存，連續(xù)觀察72h，收集尿囊液作血球凝集試驗(yàn)，出現(xiàn)血凝者判陽性，采用Reed－Muench法[4]計(jì)算EID50。

1.2.3 小鼠半數(shù)致死量 （MLD50）測定

取8周齡SPF級BALB／c雌性小鼠30只，隨機(jī)分成6組作為H9N2－SIV感染組 （感染組），用滅菌生理鹽水將病毒液從100開始作10倍梯度稀釋至10－5，每個稀釋度分別經(jīng)鼻腔滴鼻接種一組小鼠，接種劑量為0.1mL／只。另外取5只小鼠作為對照組，滴鼻接種0.1mL的經(jīng)滅菌生理鹽水5倍稀釋的正常雞胚尿囊液。接種后于ABSL－3實(shí)驗(yàn)室中正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14d，記錄各組小鼠的發(fā)病和死亡情況，按照Reed－Muench法[4]計(jì)算 MLD50。

Reed－Muench計(jì)算方法：

2 結(jié)果與分析

2.1 H9N2－SIV增殖及血凝效價(jià)測定

每枚雞胚可以收集約5mL左右尿囊液，大部分雞胚尿囊液血凝效價(jià)在1∶128～1∶1 024之間。為了避免實(shí)驗(yàn)誤差和合理運(yùn)用病毒液且不造成病毒液的浪費(fèi)，取血凝效價(jià)在1∶128～1∶1 024之間的雞胚尿囊液混合，混合后測定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)為1∶256，該病毒液 （混合雞胚尿囊液）確定為下一步試驗(yàn)用病毒原液，分裝后貯存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 H9N2－SIV感染雞胚EID50測定

將血凝效價(jià)為1∶256的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋至10－10，分別接種雞胚，結(jié)果見表3，病毒的 EID50＝10－6.5·0.1mL－1。

表3 H9N2－SIV感染雞胚EID50測定結(jié)果

2.3 H9N2－SIV感染小鼠 MLD50測定

將血凝效價(jià)為1∶256的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋，經(jīng)鼻腔滴鼻接種BALB／c小鼠，小鼠存活與死亡數(shù)目見表4。結(jié)果表明含病毒高的劑量 （低稀釋度）引起小鼠出現(xiàn)明顯的發(fā)病以及100%的死亡，隨著稀釋度的增加 （病毒含量降低），小鼠死亡相對減少，存活率增加，試驗(yàn)小鼠50%出現(xiàn)死亡的病毒稀釋度在10－2～10－3之間，按照Reed－Muench法計(jì)算 MLD50，MLD50＝10－2.32·0.l mL－1，即能使50%小鼠死亡的病毒稀釋度為10－2.32。

表4 H9N2－SIV感染小鼠MLD50測定

3 討論和結(jié)論

為保證病毒在使用時(shí)效價(jià)最高、最穩(wěn)定，且不造成浪費(fèi)，應(yīng)確定病毒滴度，即病毒的毒力，也稱為毒價(jià)。衡量毒價(jià)的單位有最小致死量 （MLD）、最小感染量 （MID）和半數(shù)致死量 （LD50）等，但由于劑量的遞增與死亡率遞增不呈線性關(guān)系，在越接近100%死亡時(shí)，對劑量的遞增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%時(shí)，對劑量的變化越敏感，所以現(xiàn)多改用半數(shù)致死量 （LD50）作為毒價(jià)測定單位，即經(jīng)規(guī)定的途徑，以不同的劑量接種試驗(yàn)動物，在一定時(shí)間內(nèi)能致半數(shù)試驗(yàn)動物死亡的病毒量。應(yīng)用半數(shù)致死量的方法有助于減少量度極端情況所帶來的問題和減少試驗(yàn)的次數(shù)，節(jié)省時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。然而，病毒對試驗(yàn)動物的致病作用不一定都以死亡為標(biāo)志，例如以感染發(fā)病作指標(biāo)，則可以測定半數(shù)感染量 （ID50）；此外，當(dāng)試驗(yàn)材料是雞胚時(shí)則用雞胚半數(shù)致死量 （ELD50）或雞胚半數(shù)感染量 （EID50）表示；試驗(yàn)材料是鼠類時(shí)則用鼠半數(shù)致死量 （MLD50）表示；試驗(yàn)材料是細(xì)胞時(shí)則用組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量 （TCID50）表示。

Reed－Muench法在病毒學(xué)研究中使用較多，適用于整體及離體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但該方法報(bào)告的信息較少，結(jié)果不如正規(guī)概率單位計(jì)算法嚴(yán)謹(jǐn)，由于是用累積法計(jì)算，計(jì)算結(jié)果有一定的缺陷，誤差也較大。盡管如此，由于該方法計(jì)算簡單、使用方便，仍是目前計(jì)算LD50、ID50等數(shù)據(jù)最常用的方法。在實(shí)際操作中一般選擇10～100個 LD50作為病毒的接種濃度[5－9]。

試驗(yàn)測定 H9N2－SIV經(jīng)雞胚增殖后病毒液的血凝效價(jià)為1∶256，病毒的EID50為10－6.5·0.1mL－1，MLD50為10－2.32·0.1mL－1，該病毒可用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。

[1]邵攀峰，何葉峰，余彬輝，等.雞胚增殖病毒技術(shù)操作要點(diǎn)[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2011，（02）：29－30.

[2]陳聲明，劉麗麗.微生物學(xué)研究法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1996：127－128.

[3]孫惠惠.H1N1小鼠模型的建立及板藍(lán)根顆粒對H1N1模型小鼠的作用的研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2010.

[4]殷震，劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

[5]蒲秀瑛.貫葉連翹提取物對甲型流感病毒的作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D].甘肅：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[6]楊子峰，劉妮，黃碧松，等.牛蒡子甙元體內(nèi)抗甲Ⅰ型流感病毒作用的研究[J].中藥材，2005，28（11）：1012－1014.

[7]張烜榕，王濤，申元英，等.甲型流感病毒感染BALB／c鼠動物模型的建立[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，6（10）：25－27.

[8]杜淑娟，程樹軍，袁美鳳.副流感病毒小鼠動物模型的建立及病理學(xué)研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（07）：387－389.

[9]張瑞莉，劉明，張卓.鵝源H5N1亞型禽流感病毒感染雛雞免疫器官細(xì)胞凋亡的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（03）：177－180.