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    H9N2亞型豬流感病毒的增殖及毒力測(cè)定

    2013-11-29 08:50:22
    關(guān)鍵詞:小鼠

    魏 東

    (河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河北 張家口075000)

    0 前 言

    病毒缺乏增殖所需要的酶系統(tǒng),只能在有感受性的活的宿主細(xì)胞內(nèi)增殖,即以病毒基因?yàn)槟0?,進(jìn)行自我復(fù)制。試驗(yàn)所使用的豬流感病毒株經(jīng)過(guò)-70℃低溫貯存,其毒力有較大差別,病毒有必要進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng),和增殖。雞胚接種法、動(dòng)物接種法和組織培養(yǎng)法是目前常用的病毒培養(yǎng)方法。雞胚是正在發(fā)育的活體,病毒在雞胚中易于生長(zhǎng)和增殖,多種病毒都能在雞胚中進(jìn)行傳代[1];而且SPF雞胚來(lái)源容易、無(wú)病毒的隱性感染、對(duì)培養(yǎng)條件無(wú)特殊要求,接種途徑和時(shí)間的可選性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單,胚胎的組織分化程度低,沒(méi)有明顯的自身組織特征,病毒在雞胚中易于增殖,部分病毒感染雞胚以后可以產(chǎn)生痘斑,引起充血、出血、壞死灶和死亡等特異性感染指征。對(duì)于大多數(shù)病毒來(lái)說(shuō),雞胚接種法是最為常用的病毒培養(yǎng)方法,其中雞胚尿囊腔接種法是目前最常用的病毒增殖方式。本研究采用雞胚尿囊腔增殖法對(duì)試驗(yàn)用H9N2-SIV毒株進(jìn)行增殖,在病毒增殖后進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)雞胚和小鼠的毒力。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 病毒和主要試劑

    H9N2亞型豬流感病毒A/swine/HeBei/012/2008 (H9N2) (H9N2-SIV)由本課題組分離,經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定,河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

    其他試驗(yàn)藥品均為分析純,試劑由課題組自配。

    1.1.2 主要儀器設(shè)備

    GRUMBACH孵蛋器,德國(guó)Grumbach公司;Heraeus Fresco 17離心機(jī)、超低溫冰箱、Thermo 1300series A2生物安全柜、微量加樣器,美國(guó)Thermo Scientific公司;電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,寧波江南儀器廠(chǎng);照蛋器,青島興儀電子設(shè)備有限公司;V形血凝板,上海基星生物科技有限公司。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    6~8日齡SPF雞胚 (北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)[SCXK (京)2009-0003],于接種前進(jìn)行孵化至10日齡;

    8周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠 (北京華阜康生物科技股份有限公司)[SCXK (京)2009-0004];

    動(dòng)物試驗(yàn)在中國(guó)人民解放軍251醫(yī)院三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室 (BSL-3,P3)進(jìn)行 [SYXK (軍)2007-018],并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

    1.2 方法

    1.2.1 H9N2-SIV的增殖及血凝效價(jià)測(cè)定

    將病毒原液作10倍稀釋?zhuān)捎秒u胚尿囊腔接種法[2]將H9N2-SIV病毒接種于10日齡雞胚,收取尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)。

    1.2.1.1 H9N2-SIV的增殖-雞胚尿囊腔接種法

    (1)驗(yàn)蛋,判斷活胚或死胚。取10日齡的SPF雞胚30只,先檢查雞胚外觀,有裂痕、發(fā)育不全或有其它問(wèn)題的雞胚應(yīng)棄掉不用。然后用照蛋器檢測(cè),根據(jù)正常雞胚標(biāo)準(zhǔn)對(duì)雞胚進(jìn)行判別,對(duì)于不符合要求的死胚、無(wú)受精胚等棄掉不用。對(duì)于可用雞胚,標(biāo)記雞胚的尿囊與氣室的界限和胚胎位置,并在氣室端、雞頭方的雞胚尿囊膜邊緣上方0.5cm處避開(kāi)血管作一標(biāo)記 (注射點(diǎn))。

    表1 雞胚標(biāo)準(zhǔn)

    (2)消毒。取干凈已消毒蛋盤(pán),將雞胚氣室朝上豎放于蛋盤(pán)上,在氣室部和標(biāo)記處先后用碘酊和酒精消毒蛋殼表面,用打孔器在標(biāo)記處鉆一小孔。

    (3)接種。取l mL注射器吸取病毒液,由鉆孔處垂直進(jìn)針,經(jīng)絨毛尿囊膜注入0.1mL病毒液到尿囊腔中。

    (4)封孔。接種前先將石蠟融化,待接種后立即用石蠟將蛋殼上的針孔完全封閉,并做標(biāo)記。

    (5)孵育。將接種后的雞胚放入37℃溫箱中孵育48~72h(相對(duì)濕度為45%~60%),接種后24h照胚,將24h內(nèi)死亡的雞胚棄去 (因機(jī)械操作、細(xì)菌或霉菌污染等非特性因素所引起,認(rèn)為是非特異死亡),以后每4~6h照胚檢查1次,隨時(shí)取出死亡雞胚,放入2~8℃冷胚。

    (6)冷胚。雞胚在收獲前置4℃冰箱6h或過(guò)夜 (使血液凝固,以免收獲時(shí)流出紅細(xì)胞,并同尿囊液的病毒發(fā)生凝集,造成病毒滴度下降,但不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng);如急于收胚也可將雞胚置于-20℃、1h左右)。

    (7)收胚。把冷卻好的雞胚氣室向上放在蛋盤(pán)上置于無(wú)菌室,將雞胚氣室部表面先后用碘酊和酒精消毒。先用無(wú)菌鑷子擊破氣室部卵殼并輕輕將蛋殼剝除,然后小心將氣室部殼膜從絨毛尿囊膜撕去,并將其翻開(kāi)到卵殼邊上 (不要損傷絨毛尿囊膜),另?yè)Q兩把無(wú)菌眼科鑷子在絨毛尿囊膜上撕開(kāi)一小口,用一把眼科鑷子斜插入絨毛尿囊膜輕輕壓住胚胎,用滅菌注射器或移液器吸取尿囊液 (病毒液)于無(wú)菌EP管中(如操作時(shí)損傷了血管或胚胎,尿囊液混濁,則棄去不用),將尿囊收獲液 (病毒液)于3 000r·min-1離心5min去除里面的雜質(zhì)[3],標(biāo)記后置低溫冰箱中保存待檢。

    1.2.1.2 血凝 (HA)試驗(yàn)測(cè)定病毒液效價(jià)

    為使下一步的試驗(yàn)順利進(jìn)行,需要測(cè)定病毒與紅細(xì)胞的凝集價(jià),以確定試驗(yàn)所用病毒的稀釋倍數(shù) (抗原單位)。本試驗(yàn)采用微量法,在V形血凝板上進(jìn)行。

    (1)取50μL的生理鹽水加入96孔V型血凝板A-H行的1~12孔;

    (2)被檢病毒液50μL分別加入A-H行的第1孔,然后抽取50μL倍比稀釋至第11孔,棄去50μL,12孔不加作為陰性對(duì)照;

    (3)從低濃度至高濃度,每孔加入50μL 1%雞紅細(xì)胞懸液 (采健康雄雞血液5~10mL于提前已加入4%枸椽酸鈉抗凝劑的大試管中,生理鹽水將血漿、白細(xì)胞等充分洗去,2 000r·min-1離心5~10min,共洗滌3~5次,最后將洗后的紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋成1%的懸浮液,置4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

    (4)輕輕振蕩混勻、37℃靜置20min;

    (5)觀察結(jié)果,根據(jù)發(fā)生凝集反應(yīng)病毒的稀釋倍數(shù)確定HA滴度。

    結(jié)果判定:將V形血凝板傾斜至45°,如果紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線(xiàn)狀流動(dòng)者,表明紅細(xì)胞與病毒沒(méi)有或不完全凝集;如果紅細(xì)胞平鋪于孔底,凝成均勻薄層,傾斜后也不流動(dòng),說(shuō)明紅細(xì)胞被病毒凝集。

    表2 血凝試驗(yàn)方法 (μL)

    1.2.2 雞胚半數(shù)感染量 (EID50)的測(cè)定

    用滅菌生理鹽水將1.2.1所選擇的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋至10-10。然后通過(guò)尿囊腔途徑分別接種于10日齡雞胚尿囊腔,0.1mL/胚,每個(gè)稀釋度接種5枚雞胚,石蠟封口,置37℃溫箱中孵育,具體操作方法同1.2.1,每12h觀察一次,24h之內(nèi)死亡的雞胚棄掉,24h之后死亡的雞胚置4℃保存,連續(xù)觀察72h,收集尿囊液作血球凝集試驗(yàn),出現(xiàn)血凝者判陽(yáng)性,采用Reed-Muench法[4]計(jì)算EID50。

    1.2.3 小鼠半數(shù)致死量 (MLD50)測(cè)定

    取8周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠30只,隨機(jī)分成6組作為H9N2-SIV感染組 (感染組),用滅菌生理鹽水將病毒液從100開(kāi)始作10倍梯度稀釋至10-5,每個(gè)稀釋度分別經(jīng)鼻腔滴鼻接種一組小鼠,接種劑量為0.1mL/只。另外取5只小鼠作為對(duì)照組,滴鼻接種0.1mL的經(jīng)滅菌生理鹽水5倍稀釋的正常雞胚尿囊液。接種后于ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中正常飼養(yǎng),連續(xù)觀察14d,記錄各組小鼠的發(fā)病和死亡情況,按照Reed-Muench法[4]計(jì)算 MLD50。

    Reed-Muench計(jì)算方法:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 H9N2-SIV增殖及血凝效價(jià)測(cè)定

    每枚雞胚可以收集約5mL左右尿囊液,大部分雞胚尿囊液血凝效價(jià)在1∶128~1∶1 024之間。為了避免實(shí)驗(yàn)誤差和合理運(yùn)用病毒液且不造成病毒液的浪費(fèi),取血凝效價(jià)在1∶128~1∶1 024之間的雞胚尿囊液混合,混合后測(cè)定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)為1∶256,該病毒液 (混合雞胚尿囊液)確定為下一步試驗(yàn)用病毒原液,分裝后貯存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 H9N2-SIV感染雞胚EID50測(cè)定

    將血凝效價(jià)為1∶256的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋至10-10,分別接種雞胚,結(jié)果見(jiàn)表3,病毒的 EID50=10-6.5·0.1mL-1。

    表3 H9N2-SIV感染雞胚EID50測(cè)定結(jié)果

    2.3 H9N2-SIV感染小鼠 MLD50測(cè)定

    將血凝效價(jià)為1∶256的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋?zhuān)?jīng)鼻腔滴鼻接種BALB/c小鼠,小鼠存活與死亡數(shù)目見(jiàn)表4。結(jié)果表明含病毒高的劑量 (低稀釋度)引起小鼠出現(xiàn)明顯的發(fā)病以及100%的死亡,隨著稀釋度的增加 (病毒含量降低),小鼠死亡相對(duì)減少,存活率增加,試驗(yàn)小鼠50%出現(xiàn)死亡的病毒稀釋度在10-2~10-3之間,按照Reed-Muench法計(jì)算 MLD50,MLD50=10-2.32·0.l mL-1,即能使50%小鼠死亡的病毒稀釋度為10-2.32。

    表4 H9N2-SIV感染小鼠MLD50測(cè)定

    3 討論和結(jié)論

    為保證病毒在使用時(shí)效價(jià)最高、最穩(wěn)定,且不造成浪費(fèi),應(yīng)確定病毒滴度,即病毒的毒力,也稱(chēng)為毒價(jià)。衡量毒價(jià)的單位有最小致死量 (MLD)、最小感染量 (MID)和半數(shù)致死量 (LD50)等,但由于劑量的遞增與死亡率遞增不呈線(xiàn)性關(guān)系,在越接近100%死亡時(shí),對(duì)劑量的遞增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%時(shí),對(duì)劑量的變化越敏感,所以現(xiàn)多改用半數(shù)致死量 (LD50)作為毒價(jià)測(cè)定單位,即經(jīng)規(guī)定的途徑,以不同的劑量接種試驗(yàn)動(dòng)物,在一定時(shí)間內(nèi)能致半數(shù)試驗(yàn)動(dòng)物死亡的病毒量。應(yīng)用半數(shù)致死量的方法有助于減少量度極端情況所帶來(lái)的問(wèn)題和減少試驗(yàn)的次數(shù),節(jié)省時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。然而,病毒對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的致病作用不一定都以死亡為標(biāo)志,例如以感染發(fā)病作指標(biāo),則可以測(cè)定半數(shù)感染量 (ID50);此外,當(dāng)試驗(yàn)材料是雞胚時(shí)則用雞胚半數(shù)致死量 (ELD50)或雞胚半數(shù)感染量 (EID50)表示;試驗(yàn)材料是鼠類(lèi)時(shí)則用鼠半數(shù)致死量 (MLD50)表示;試驗(yàn)材料是細(xì)胞時(shí)則用組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量 (TCID50)表示。

    Reed-Muench法在病毒學(xué)研究中使用較多,適用于整體及離體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),但該方法報(bào)告的信息較少,結(jié)果不如正規(guī)概率單位計(jì)算法嚴(yán)謹(jǐn),由于是用累積法計(jì)算,計(jì)算結(jié)果有一定的缺陷,誤差也較大。盡管如此,由于該方法計(jì)算簡(jiǎn)單、使用方便,仍是目前計(jì)算LD50、ID50等數(shù)據(jù)最常用的方法。在實(shí)際操作中一般選擇10~100個(gè) LD50作為病毒的接種濃度[5-9]。

    試驗(yàn)測(cè)定 H9N2-SIV經(jīng)雞胚增殖后病毒液的血凝效價(jià)為1∶256,病毒的EID50為10-6.5·0.1mL-1,MLD50為10-2.32·0.1mL-1,該病毒可用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。

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