RET基因多態(tài)性與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)聯(lián)性分析

王 崇，劉曉莉，史杰萍，吳燕華，王詩鑌，于雅琴，孫 輝

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院甲狀腺外科，吉林 長春 130033）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，占機(jī)體所有惡性腫瘤的1%［1］，其主要包括乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、髓 樣 癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）、濾泡狀癌和未分化癌4種類型，其中以PTC最為常見［2］。甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，有研究［3］表明：女性、亞洲人種、學(xué)歷高、有甲狀腺腫病史、頸部接受過放射線照射和有甲狀腺疾病家族史是甲狀腺癌的危險(xiǎn)因素。也有研究表明：甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展與某些基因及其基因的多態(tài)性有關(guān)，如RET原癌基因、TSHR基因、BARF基因和Ras基因等。L?nn等［4］和Ho等［5］已報(bào)道過 RET 基因多態(tài)性與PTC的發(fā)生有關(guān)。本研究采用病例對照的方法，通過檢測RET基因外顯子11上的rs1799939位點(diǎn)的基因多態(tài)性，探討該單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點(diǎn)與PTC的關(guān)聯(lián)性，為今后揭示甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制提供一定的遺傳學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2010年1—5月在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院通過手術(shù)后病理切片確診的100例PTC患者作為病例組，按年齡、性別、民族和地理位置匹配，選取同期在吉林大學(xué)第一醫(yī)院進(jìn)行體檢的100例排除腫瘤及甲狀腺相關(guān)疾病的健康人為對照組。研究對象均為中國北方漢族人群。所有PTC均依據(jù)《2009年美國甲狀腺學(xué)會(huì)甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診斷治療指南》確診。

1.2 標(biāo)本的采集及處理 在獲取研究對象的知情同意后，抽取外周靜脈血5mL，EDTA抗凝，－20℃凍存以備基因組DNA的提取。

1.3 基因組DNA的提取 利用微量DNA提取試劑盒（Promega公司，美國）提取DNA，采用紫外分光光度計(jì)（Beckman公司，美國）檢測DNA含量，測定吸光度（A）值，A260／A280比值為1.6～2.0，提取出的DNA置于4℃冰箱保存。

1.4 引物設(shè)計(jì) 在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫里下載RET基因rs1799939位點(diǎn)的模板序列，利用Primer Premier 5.0軟件，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)1對引物。上游引物：5′－CACAAGCCACCCATCTCC－3′，下游引物：5′－GAACGGCACCTCATCATAGTC－3′，PCR產(chǎn)物片段長度為342bp。

1.5 基因型檢測 采用PCR－RFLP方法進(jìn)行基因型檢測：①PCR反應(yīng)體系及條件。反應(yīng)體系為25μL，含有2×Tag混合DNA聚合酶（北京天根生物公司）12.5μL（0.1U），上、下游引物（大連寶生物公司）各1.0μL（10μmol·L－1），ddH2O（二餾滅菌水）8.5μL，模板DNA（25～35ng）2.0μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，58.3℃退火1min，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物6μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳30min，電泳后用凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio－Rad公司，美國）進(jìn)行照相和保存。②酶切體系及反應(yīng)條件。利用限制性內(nèi)切酶BanⅠ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切體系為20μL，包括PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，限制性內(nèi)切酶BanⅠ1.0μL，10×Buffer 2.0μL，ddH2O 7.0μL。酶切體系在37℃恒溫箱中酶切4～5h后，用2.5%瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察酶切圖譜，判斷位點(diǎn)的基因型并照相保存。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析病例組和對照組基因型分布是否符合Hardy－Weinberg平衡定律，以及該位點(diǎn)的基因型、等位基因頻數(shù)分布與PTC的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié) 果

2.1 2組研究對象的基本情況 病例組100例，其中男性24例，女性76例，平均年齡為（42.02±8.96）歲。對照組100例，其中男性26例，女性74例，平均年齡為（43.03±10.12）歲，病例組和對照組的年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.747，P＝0.456；χ2＝0.107，P＝0.744），具有可比性。

2.2 PCR擴(kuò)增和酶切結(jié)果 RET基因上rs1799939位點(diǎn)是呈二態(tài)性的SNP位點(diǎn)，有G和A 2種等位基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因片段長度為342bp。見圖1。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BanⅠ消化后，可能產(chǎn)生2個(gè)酶切片段，長度分別為80和262bp。本研究檢測出2種基因型，分別為G／G基因型（純合切開）和G／A基因型（雜合切開），未發(fā)現(xiàn)A／A基因型（純合未切開）。見圖2。

2.3 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)，該位點(diǎn)病例組和對照組的基因型頻數(shù)分布均符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡定律（P＞0.05）。見表1。

圖1 rs1799939位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoregram of PCR amplification products of rs1799939site

圖2 rs1799939位點(diǎn)限制性酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoregram of RFLP products of rs1799939site

2.4 rs1799939位點(diǎn)與PTC的關(guān)聯(lián)性分析 病例組和對照組G／G、G／A 2種基因型頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.276，P＝0.599），G、A等位基因頻數(shù)分布差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.245，P＝0.621），ORGA／GG＝1.202（95%CI：0.604～2.393），ORA／G＝1.177（95%CI：0.616～2.250），rs1799939位點(diǎn)的多態(tài)性與PTC不存在關(guān)聯(lián)。見表2。

表1 rs1799939位點(diǎn)的Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)Tab.1 The goodness of fit chi－square test for the Hardy－Weinberg equilibrium of rs1799939site

2.5 rs1799939位點(diǎn)在不同性別PTC患者中的分布 按性別將病例組PTC患者分為男性、女性2組，進(jìn)行基因型頻數(shù)和等位基因頻數(shù)的χ2檢驗(yàn)，經(jīng)檢驗(yàn)，不同性別的PTC患者在rs1799939位點(diǎn)的基因型頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.025，P＝0.874），G、A等位基因頻數(shù)分布差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.022，P＝0.882）。見表3。

表2 rs1999939位點(diǎn)基因型和等位基因頻數(shù)分布Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequencies of rs1799939site ［n（η／%）］

表3 不同性別PTC患者基因型和等位基因頻數(shù)分布Tab.3 Distribution of genotypic and allelic frequencies in PTC patients with different genders ［n（η／%）］

3 討 論

近年來甲狀腺癌的發(fā)病率呈增高趨勢，世界各地女性患者的發(fā)病率均高于男性。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署（IARC，http：／／www.iarc.fr／）［6］報(bào)道，全球男性甲狀腺癌發(fā)病率由2000年的1.2／10萬增加到2008年的1.5／10萬，女性由3.0／10萬增加到4.7／10萬，呈現(xiàn)逐年上升趨勢。我國天津、上海、海門等城市的流行病學(xué)調(diào)查也顯示甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增高［7－9］。

RET原癌基因最先由Takahashi等［10］發(fā)現(xiàn)。該基因位于人類染色體10q11.2，共含有21個(gè)外顯子，全長60000bp，能夠編碼一種跨膜的酪氨酸激酶受體蛋白（RET蛋白），這種受體在神經(jīng)嵴細(xì)胞系中表達(dá)，對細(xì)胞的正常生理功能有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)該蛋白也與細(xì)胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。目前國外已有研究報(bào)道RET基因多態(tài)性與甲狀腺癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。L?nn等［4］研究表明：RET基因rs1799939位點(diǎn)的多態(tài)性與PTC的發(fā)生有關(guān)，且這種關(guān)聯(lián)性在年輕女性中表現(xiàn)更強(qiáng)。Elisei等［11］通過對106例健康人和106例MTC患者rs1799939位點(diǎn)基因型的檢測發(fā)現(xiàn)MTC的發(fā)生與該位點(diǎn)存在關(guān)聯(lián)性。2012年，F(xiàn)iglioli等［12］采用 Meta分析的方法也證實(shí)了rs1799939位點(diǎn)的多態(tài)性可以增加患甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。國內(nèi)此類研究則較少。

本研究采用病例－對照研究方法，利用PCR－RFLP技術(shù)探討RET基因第11外顯子上rs1799939位點(diǎn)多態(tài)性與PTC的關(guān)系。分析結(jié)果表明：該位點(diǎn)的基因多態(tài)性與PTC的發(fā)生不存在關(guān)聯(lián)，與不同性別的PTC患者的發(fā)病也不存在關(guān)聯(lián)。這個(gè)結(jié)果與Ho等［5］的研究結(jié)果一致。本研究得到陰性結(jié)果的可能原因是：①樣本量較小，選取位點(diǎn)單一，能夠提供的信息量有一定限制，不足以得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。有研究［13－14］表明：多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)聯(lián)合作用時(shí)可以增加甲狀腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。②甲狀腺癌的病因很多，可能在發(fā)病的過程中有多個(gè)基因聯(lián)合作用，而每個(gè)基因所起的作用相對微小，因此在檢驗(yàn)單個(gè)RET基因與甲狀腺癌的關(guān)系時(shí)可能難以達(dá)到顯著性水平。③甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，除了已知的RAF／MEK／ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和PI3K／Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路外，可能還存在其他未知的通路起著重要的作用。④甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展除了遺傳因素外，還與環(huán)境因素有關(guān)，本研究未探討環(huán)境因素的作用，可能會(huì)導(dǎo)致陰性結(jié)果。⑤由于本研究的研究對象與陽性結(jié)果的研究對象在地理位置、遺傳背景、種族和生活環(huán)境等方面存在差異，也有得到陰性結(jié)果的可能。⑥本研究病例組的癌癥病理類型為PTC，可能會(huì)與部分研究結(jié)果不一致。

綜上所述，本研究雖未發(fā)現(xiàn)rs1799939位點(diǎn)的多態(tài)性與中國北方漢族人群PTC的易感性存在關(guān)聯(lián)，但尚不能完全排除rs1799939位點(diǎn)在PTC發(fā)生中的作用。在今后的研究中，為了獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果，可以擴(kuò)大研究的樣本量，增加研究的多態(tài)性位點(diǎn)，同時(shí)檢測多個(gè)與甲狀腺癌的發(fā)生可能有關(guān)的基因，對相關(guān)資料進(jìn)行單倍體型分析、基因－基因的交互作用分析、基因－環(huán)境的交互作用分析，進(jìn)一步探討甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制。

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