全反式維甲酸對(duì)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其分子機(jī)制

李海燕，曹勵(lì)民，賀紅艷，黃鳳霞

（西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021）

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移影響了肝癌患者的預(yù)后。抑制肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移可延長(zhǎng)肝癌患者的生存期，改善其生活質(zhì)量。全反式維甲酸（all－trans retinoic acid，ATRA）為維生素A的氧化代謝產(chǎn)物，是常用的誘導(dǎo)分化劑。近年研究［1－3］發(fā)現(xiàn)：ATRA 及其衍生物除廣泛應(yīng)用于白血病的治療外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)還證實(shí)其可促進(jìn)多種實(shí)體瘤細(xì)胞的分化，明顯抑制乳腺癌、肝癌和胃癌細(xì)胞等的侵襲和轉(zhuǎn)移。ATRA誘導(dǎo)分化對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移可能具有一定的預(yù)防和治療作用，但具體的分子機(jī)制尚不十分清楚。因此本文作者探討ATRA對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721增殖、遷移和侵襲能力的影響及其分子機(jī)制，旨在為ATRA用于肝癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721引自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；ATRA購(gòu)自Sigma公司，用二甲基亞礬（DMSO）配制濃度為10mmol·L－1的存儲(chǔ)液，分裝后于－20℃避光保存。RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物工程公司），Transwell小室（3428型，美國(guó) Coming公司），Matrigel（5g·L－1），美國(guó)BD公司），Total RNA Kit（美國(guó) Omega 公司），F(xiàn)luorophore Sybr Green（Netherlands公司）。BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Pierce公司），ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP－9）和α－tublin一抗（美國(guó)ABCAM公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721培養(yǎng)于含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5%CO2濃度、飽和濕度及37℃孵育箱中培養(yǎng)，3～4d傳代1次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC－7721細(xì)胞分為空白對(duì)照組和10、20和40μmol·L－1ATRA組。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，接種于96孔板，每孔200μL，5000個(gè)細(xì)胞／孔，孵育24h使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后棄上清，更換新鮮的培養(yǎng)液，180μL／孔，并加入20μL的各濃度藥液，含ATRA分別為10、20和40μmol·L－1，空白對(duì)照僅加入20μL培養(yǎng)基，每組6個(gè)復(fù)孔，置搖床上低速振蕩混勻，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入20μL／孔 MTS／PMS溶液，MTS的終質(zhì)量濃度為333μg·L－1，PMS的終濃度為25μmol·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后置搖床上低速振蕩10min，測(cè)量各孔在490nm處的吸光度（A）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以增殖率表示藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。增殖率 ＝ （各組所得到的A值／空白對(duì)照組A值）×100%。

1.5 劃痕愈合法測(cè)定細(xì)胞遷移能力 將2×106個(gè)SMMC－7721細(xì)胞接種在6孔板，培養(yǎng)至90%融合狀態(tài)，無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，換無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24h；用10μL移液器的槍頭沿培養(yǎng)板底部做“1”字劃痕，劃痕時(shí)要以直尺定位。無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，加入ATRA調(diào)節(jié)濃度為10、20和40μmol·L－1。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下在劃痕同一位置觀察并拍照，使用Image J軟件測(cè)量并統(tǒng)計(jì)劃痕區(qū)寬度。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)平行樣本。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞侵襲能力 將Transwell放入24孔板內(nèi)，Matrigel與無(wú)血清培養(yǎng)基1∶9配制，Transwell上層鋪50μL稀釋的Matrigel，37℃過夜至 Matrigel膠凝固，種植細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)，無(wú)血清培養(yǎng)基300μL，加入ATRA，調(diào)節(jié)藥物濃度為10、20和40μmol·L－1，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。24h后分別取出小室，以PBS清洗3次，用棉簽小心刮除濾膜上面的細(xì)胞，膜下面細(xì)胞用甲醛固定，并以1%結(jié)晶紫染色15min，PBS洗3次。倒置顯微鏡下高倍鏡觀察并拍照，Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)值，結(jié)果以細(xì)胞數(shù)表示。

1.7 Real－time PCR 以10、20和40μmol·L－1ATRA處理細(xì)胞，在24h以Total RNA Kit提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒要求，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。MMP－9基因引物及內(nèi)參GAPDH基因引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)參數(shù)參考相關(guān)文獻(xiàn)［4－5］，引物經(jīng)上海生物工程有限公司鑒定其合理性后生成。MMP－9，F(xiàn)：5′－TTCCCCTTCACTTTCCTGGGTA－3′，R：5′－CGCCACGAGGAACAAACTGTAT－3′；GAPDH，F(xiàn)：5′－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3′，R：5′－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3′。

使用儀器CFD3120MiniOpticon Detector（BIO－RAD，California，USA）進(jìn) 行 Real－time PCR，按照儀器使用說明書及其軟件進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)置。每個(gè)循環(huán)末自動(dòng)記錄熒光強(qiáng)度，結(jié)果應(yīng)用GraphPad.Prism.v5.0.軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相對(duì)表達(dá)量采用2－ΔΔCT方法計(jì)算，－ ΔΔCT ＝－（ΔCT0q－ΔCT0cb）［6］。

1.8 Western blotting 以10、20和40μmol·L－1ATRA處理細(xì)胞，在24h收集細(xì)胞，PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解提細(xì)胞總蛋白。蛋白質(zhì)定量變性后上樣，SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，半干標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)膜90min。將轉(zhuǎn)有蛋白條帶的膜常規(guī)封閉、洗膜后分別與特異性一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5min，二抗室溫孵育1h，TBST洗3次，每次5min，化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測(cè)定印跡區(qū)帶的A值。觀察各條帶深淺變化并加以分析，α－tublin作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果在凝膠成像儀上照相并使用Bio－Rad公司Quantity One分析軟件測(cè)量條帶灰度值，目的條帶與α－tublin條帶灰度值比值即為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，增殖率以百分比表示，劃痕距離和穿膜細(xì)胞數(shù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 ATRA作用下人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的增殖能力 空白對(duì)照組與10、20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞的增殖率分別為94%、82%、60%和34%，與空白對(duì)照組比較，20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞的增殖率明顯降低（P＜0.01）。

2.2 ATRA作用下人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的遷移能力 空白對(duì)照組SMMC－7721細(xì)胞在0h劃痕距離為（186.00±0.56）μm，在24h劃痕距離為（35.00±0.41）μm，24h細(xì)胞劃痕距離較0h明顯減少（P＜0.05），表明 SMMC－7721細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力。與空白對(duì)照組比較，10、20和40μmol·L－1ATRA組細(xì)胞在0h劃痕距離較一致；而處理24h后，10、20和40μmol·L－1ATRA組的劃痕距離分別為（37.00±0.53）、（98.00±0.62）和（107.00±0.81）μm，與空白對(duì)照組比較，10μmol·L－1ATRA組劃痕距離無(wú)明顯變化，而20和40μmol·L－1ATRA組劃痕距離明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1（封二）。

2.3 ATRA作用下人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的侵襲能力 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：10、20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞處理24h后，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（45.30±0.52）、（32.80±0.21）和（21.50±0.64）個(gè)，較空白對(duì)照組［（63.60±0.45）個(gè)］明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2（插頁(yè)一）。

2.4 ATRA作用下SMMC－7721細(xì)胞中MMP－9 mRNA和蛋白的表達(dá) Real－time PCR結(jié)果：空白對(duì)照組與10、20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞處理24h后，MMP－9mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.18、0.12、0.07和0.03，20和40μmol·L－1ATRA組MMP－9mRNA表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Western blotting結(jié)果：空白對(duì)照組與10、20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞處理24h后，MMP－9蛋白表達(dá)相對(duì)值分別為0.98、0.84、0.63和0.45，20和40μmol·L－1ATRA組蛋白表達(dá)相對(duì)值較空白對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 ATRA作用下SMMC－7721細(xì)胞中 MMP－9蛋白表達(dá)Fig.3 The MMP－9protein expression in SMMC－77211 cells after treated with ATRA

3 討 論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因。尋找有效的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物一直是藥物研發(fā)的熱點(diǎn)［7－9］。阻斷腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲和遷移過程的各環(huán)節(jié)均有可能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

ATRA作為誘導(dǎo)分化劑在急性早幼粒細(xì)胞白血病中的應(yīng)用取得了令人鼓舞的成效，這促使人們考慮其應(yīng)用于其他實(shí)體瘤的治療是否依然有效。近年來(lái)，很多研究者已從細(xì)胞學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)的角度對(duì)胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤應(yīng)用ATRA進(jìn)行誘導(dǎo)、分化的治療。初步研究的結(jié)果顯示：ATRA對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化、抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡等作用，同時(shí)在抑制實(shí)體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中也逐漸顯示其作用［10－12］。

本研究結(jié)果顯示：ATRA可以呈劑量依賴性抑制SMMC－7721細(xì)胞的增殖，20.0μmol·L－1以上摩爾濃度可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這與劉子文等［13］的研究結(jié)果相一致；表明其可呈劑量依賴性抑制SMMC－7721細(xì)胞的遷移能力。

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)是目前常用的體外研究腫瘤細(xì)胞侵襲行為的經(jīng)典方法。本研究中劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移能力，劃痕后24h，劃痕處大部分愈合。而在ATRA組，作用于SMMC－7721細(xì)胞后，其遷移能力卻非常弱，對(duì)比劃痕0h的圖片結(jié)果，經(jīng)過24h的培養(yǎng)，劃痕處未見愈合。Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著ATRA作用于SMMC－7721細(xì)胞劑量的增加、時(shí)間的延長(zhǎng)，SMMC－7721細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯低于空白對(duì)照組。提示ATRA可抑制SMMC－7721細(xì)胞的侵襲能力，這與汪思應(yīng)等［14］和李冰等［15］的研究結(jié)果一致。

MMP－9是相對(duì)分子質(zhì)量最大的基質(zhì)金屬酶，主要降解和破壞Ⅳ型膠原。Ⅳ型膠原是阻礙腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵屏障基底膜的主要成分，因此，MMP－9被認(rèn)為是腫瘤局部侵襲和轉(zhuǎn)移的重要分子。MMP－9在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的重要作用，還包括調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附和促進(jìn)腫瘤血管的生成。本研究結(jié)果顯示：ATRA無(wú)論從mRNA水平還是蛋白水平均呈劑量依賴性下調(diào) MMP－9的表達(dá)。

本研究初步證明了ATRA能夠抑制人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的抑制可能與下調(diào)MMP－9有關(guān)，進(jìn)一步的分子機(jī)制尚需深入研究。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009［J］.CA Cancer J Clin，2009，59（4）：225－249.

［2］Huagn ME，Ye YC，Chen SR，et al.Use of all－trans retinoic acid in the treatment of acute promvelocvtic leukemia ［J］.Blood，1988，72（2）：567－572.

［3］Kantarjian H，O’Brien S，Cortes J，et al.Therapeutic advances in leukemia and myelodysplastic syndrome over the past 40years［J］.Cancer，2008，113（7supp1）：1933－1952.

［4］Kong LM，Liao CG，F(xiàn)ei F，et al.Transcription factor Sp1 regulates expression of cancer－associated molecule CD147in human lung cancer［J］.Cancer Sci，2010，101（6）：1463－1470.

［5］Wang YY，Meng JS，Zhuang HJ，et al.Expressions and clinical significances of MMP－2and TIMP－2mRNA in bladder transitional cell carcinomas［J］.Chinese－German J Clin Oncol，2011，10（5）：278－281.

［6］Livak KJ，Schmittqen TD.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2－△△Ctmethod［J］.Methods，2001，25（4）：402－408.

［7］Gay ID，F(xiàn)elding－Habermann B.Contribution of platelets to tumour metastasis［J］.Nat Rev Cancer，2011，11（2）：123－134.

［8］Steeg PS，Camphausen KA，Smith QR.Brain metastases as preventive and therapeutic targets［J］.Nat Rev Cancer，2011，11（5）：352－363.

［9］Wilson WR，Hay MP.Targeting hypoxia in cancer therapy［J］.Nat Rev Cancer，2011，11（6）：393－410.

［10］Wu XZ，Shi PC，Hu P，et al.N－all－trans－retinoyl－L－proline inhibits metastatic potential of hepatocellular carcinoma cells［J］.Cell Biol Int，2006，30（8）：672－680.

［11］Simeolle AM，Colella S，Krahe K，et al.N－（4－HydroxyphenyⅠ）retinamide and nitric oxide pro－drugs exhibit apoptotic and anti－invasive effects against bone metastatic breast cancer cell［J］.Carcinogenesis，2006，27（3）：568－577.

［12］Wu Q，Cheu YQ，Cheu ZM，et al.Effects of retiuoic acid on metastasis and its related proteins in gastric cancer celld in vivo and vitro［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23（9）：835－841.

［13］劉子文，劉長(zhǎng)征，劉 衛(wèi)，等.全反式維甲酸抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究［J］.中華肝膽外科雜志，2012，18（5）：386－388.

［14］汪思應(yīng)，江 巖，鄭 紅，等.全反式維甲酸抑制Ets－1介導(dǎo)的肝癌7402細(xì)胞離散和侵襲及其分子機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（6）：689－693.

［15］李 冰，田 波.全反式維甲酸對(duì)肝癌細(xì)胞分泌Ⅳ膠原酶的影響［J］.肝膽胰外科雜志，2003，15（4）：232－233.