吲哚美辛聯(lián)合X線照射對人急性髓系白血病HL－60細胞的增殖抑制作用

王 波，顧俊蓮，戴玉鑫，佟力軍，孟令娜，李 揚

（1.內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 022150；2.吉林大學白求恩醫(yī)學院病理生理學教研室，吉林 長春 130021）

放射治療是惡性腫瘤的主要治療方法，約70%的癌癥患者在治療過程中需要采用放射治療，但由于放射治療副作用大，預后不良，所以對于惡性腫瘤的聯(lián)合治療已經(jīng)越來越引起人們的重視。解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥是一類具有抗炎、鎮(zhèn)痛，多數(shù)還具有抗炎抗風濕作用的藥物。近期研究［1－2］發(fā)現(xiàn)：這類藥物不但能降低惡性腫瘤患病的危險性，而且能抑制乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞的增殖。吲哚美辛是具有代表性的一類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，國外研究［3］證實其對多種癌細胞具有抑制作用，但該藥物聯(lián)合放射治療對人急性髓系白血病的治療作用尚無相關(guān)報道。本實驗研究吲哚美辛聯(lián)合放射治療處理人急性髓系白血病HL－60細胞，觀察其對癌細胞的增殖抑制作用，為抗腫瘤研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 HL－60細胞購自上海中科院細胞庫，IMDM和胎牛血清購自Gibco公司，吲哚美辛購自Sigma公司，實時熒光定量PCR mix購自Takala公司，MTT和臺盼藍購自上海鼎國公司。

1.2 細胞培養(yǎng) HL－60細胞培養(yǎng)于含10%血清的IMDM中，37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)傳代，次日傳代，更換新鮮培養(yǎng)基。新鮮接種的細胞換成含2%血清的IMDM，同時加入不同濃度（0、20、40、60、80和100μmol·L－1）的吲哚美辛處理細胞。放射劑量根據(jù)文獻選用3Gy進行放射治療。放射處理條件：照射時在培養(yǎng)瓶下加墊厚度為2cm等效有機玻璃板，細胞在室溫下用直線加速器上的6MV X線照射，單次照射劑量分別為3Gy，平均劑量率為180cGy·min－1。

1.3 MTT法檢測細胞的增殖 取對數(shù)生長期的HL－60細胞，按每孔2×104接種于96孔板里，培養(yǎng)24h后，更換成含2%血清的IMDM，同時加入不同濃度（20、40、60、80和100μmol·L－1）的吲哚美辛處理細胞，每組設(shè)6個復孔，在37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)48h，每孔加入20μL MTT，繼續(xù)孵育4～6h，棄上清，加入150μL DMSO，輕輕混勻，于酶標儀470nm處測吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率＝（1－實驗組A570值／對照組A570值）×100%。

1.4 臺盼藍染色法檢測細胞活力 實驗設(shè)不加吲哚美辛的對照組、80μmol·L－1吲哚美辛組、3Gy X線照射組和吲哚美辛（80μmol·L－1）聯(lián)合照射（3Gy X線）組。細胞消化成單細胞懸液，采用0.4%臺盼藍染色并細胞計數(shù)，死細胞為藍紫色，活細胞為透明色，重復3次，取平均值，計算細胞活力抑制率，細胞活力抑制率（%）＝ ［1－（實驗組A值－空白對照組A值）／（對照組A值－空白對照A值）］×100%。

1.5 RT－PCR檢測 HL－60細胞中 mRNA的表達用TRIzol試劑提取細胞總RNA，采用dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶等將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取適量進行PCR反應(yīng)。GAPDH 實時引物序列：Sense，5′－AGAAGGCTGGGGCTCATTTG －3′；Antisense，5′－AGGGGCCATCCACAGTCTTC－3′，設(shè)計30個循環(huán)，退火溫度為58℃。PCNA實時引物序列：Sense，5′－GGTCCAGGGCTCCATCCT－3′；Antisense，5′－CCAGCAGGCCTCGTTGAT－3′，設(shè)計30個循環(huán)，退火溫度為56℃。Caspase－3實時引物序列：Sense，5′－TAACCAGGTGCTGTGGAGTA－3′；Antisense，5′－GTGGAATTGATGCGTGATGT－3′，設(shè)計30個循環(huán)，退火溫度為50℃。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，細胞增殖抑制率和細胞活力抑制率以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細胞增殖抑制率的變化 MTT結(jié)果顯示：與對照組比較，在3Gy X線照射下，80μmol·L－1吲哚美辛聯(lián)合照射組細胞的增殖抑制率最高；與對照組比較，80、100和200μmol·L－1吲哚美辛聯(lián)合照射組細胞的增殖抑制率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細胞活力抑制率的變化 與對照組比較，80μmol·L－1吲哚美辛聯(lián)合3Gy X線照射組細胞活力抑制率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 吲哚美辛聯(lián)合照射作用下 HL－60細胞中PCNA和Caspase－3mRNA表達的變化 與對照組比較，80μmol·L－1吲哚美辛聯(lián)合3Gy X線照射組HL－60細胞中PCNA mRNA表達明顯降低（P＜0.01），Caspase－3mRNA表達明顯增加（P＜0.01）。見圖1和表3。

表1 不同濃度吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細胞的增殖抑制率Tab.1 The inhibitory rates of proliferation of HL－60cells after treated with different concentrations of indometnacin combined with radiation （n＝6，，η／%）

表1 不同濃度吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細胞的增殖抑制率Tab.1 The inhibitory rates of proliferation of HL－60cells after treated with different concentrations of indometnacin combined with radiation （n＝6，，η／%）

＊ P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with control group.

0±0.12 0±0.08 Indometnacin 40μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation 1.57±0.01 19.07±0.1260μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation 13.85±0.05 32.55±0.0780μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation 45.89±0.14＊＊ 56.13±0.09＊＊100μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation 25.73±0.08＊ 32.03±0.0624h 48h Control（0μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation）Group Inhibitoryrate＊

表2 吲哚美辛聯(lián)合3Gy X線照射作用下HL－60的細胞活力抑制率Tab.2 The inhibitory rates of viabilities of HL－60cells after treated with indometnacin combined with radiation（n＝6，，η／%）

表2 吲哚美辛聯(lián)合3Gy X線照射作用下HL－60的細胞活力抑制率Tab.2 The inhibitory rates of viabilities of HL－60cells after treated with indometnacin combined with radiation（n＝6，，η／%）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.05compared with indometnacin group；#P＜0.05compared with 3Gy X－rays radiation group.

Group Inhibitoryrate 24h 48h Control 15.24±3.21 12.68±3.59 Indometnacin（80μmol·L－1）34.34±2.16 30.02±5.473Gy X－rays radiation 59.42±2.43＊ 53.13±5.17＊Indometnacin（80μmol·L－1）＋3Gy X－rays radiation 78.35±4.13＊△#75.42±3.91＊＊△#

圖1 吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細胞中PCNA和Caspase－3mRNA 的表達Fig.1 The expressions of PCNA and Caspase－3mRNA in HL－60cells after treated with indometnacin combined with radiation

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計，白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3%，是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤［4－6］。在世界各國中歐洲和北美白血病的發(fā)病率最高，其死亡率為3.2～7.4／10萬人口。亞洲和南美洲發(fā)病率較低，死亡率為2.8～4.5／10萬人口。白血病的治療一直局限于放化療，但不良反應(yīng)多，已有文獻報道白血病患兒因放療引起粒細胞趨化、游走、吞噬及滅菌功能降低，感染發(fā)生率高。人照射的最低損傷限度為1Gy，而半數(shù)致死量（LD50）為4Gy，因此應(yīng)嚴格避免急性過量照射引起的細胞損傷［7］。同時放療還可引起嚴重的骨壞死，雖然有很多檢測指標用以預防，但效果不是十分理想。所以單純放療使病情預后差，并嚴重影響患者的生存質(zhì)量。吲哚美辛是一種最常見的非甾體抗炎藥，文獻［8－9］報道：常規(guī)服用吲哚美辛可以減輕喉癌以及多種惡性腫瘤的危險性，這可能與其減輕氧化損傷、減少腫瘤血管的再生和營養(yǎng)，降低腫瘤的轉(zhuǎn)移率有關(guān)［10－11］；且腫瘤患者術(shù)后應(yīng)用吲哚美辛栓可改善細胞免疫功能［12］。相關(guān)研究［13］表明：吲哚美辛對抗癌癥的機制可能與調(diào)節(jié)一些凋亡相關(guān)因子例如上調(diào)p53表達和bax／bcl－2比值或增強cox－2表達及誘發(fā)凋亡有關(guān)。人類急性T細胞白血病細胞系Jurkat細胞在維甲酰酚胺聯(lián)合吲哚美辛治療后通過凋亡誘導因子（apoptosis－inducing factor，AIF）－介導細胞死亡程序誘導細胞死亡［14］。吲哚美辛聯(lián)合放療在髖關(guān)節(jié)成形術(shù)后防止異位成骨方面比單獨應(yīng)用吲哚美辛具有更好的效果［15］。

表3 各組HL－60細胞中PCNA和Caspase－3mRNA的表達水平Tab.3 The expression levels of PCNA and Caspase－3mRNA in HL－60cells in various groups（n＝6，）

表3 各組HL－60細胞中PCNA和Caspase－3mRNA的表達水平Tab.3 The expression levels of PCNA and Caspase－3mRNA in HL－60cells in various groups（n＝6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.05compared with indometnacin group；#P＜0.05compared with 3Gy X－rays radiation group.

Group GAPDH PCNA Caspase－327.53±1.21 22.28±1.23 15.86±1.34 Indometnacin（80μmol·L－1）29.97±1.33 19.24±1.43 18.51±1.613Gy X－rays radiation 30.21±1.29 17.42±0.95＊ 22.43±1.35＊Indometnacin（80μmol·L－1）＋3Gy X－rays radiation 28.69±1.46 12.31±0.74＊＊△# 25.88±0.96＊＊△#Control

本實驗結(jié)果證實：吲哚美辛聯(lián)合照射處理可明顯抑制HL－60細胞的增殖，促進凋亡。實時定量PCR檢測顯示：核增殖因子PCNA在聯(lián)合治療組明顯降低，凋亡最后執(zhí)行因子Caspase－3表達在聯(lián)合治療組明顯升高，表明吲哚美辛聯(lián)合照射處理增強了癌癥治療效果。本實驗結(jié)果提示：吲哚美辛聯(lián)合照射處理能減輕長期單獨照射帶來的不良反應(yīng)，對于白血病的治療有潛在的應(yīng)用前景。但具體的作用機制尚未明確，是否還有其他細胞調(diào)節(jié)因子參與需進一步研究證實。

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