藏羚羊與藏綿羊小腸嗜銀細(xì)胞的觀測(cè)

韓 梅

(青海省藏醫(yī)藥研究院藥物研究所，青海 西寧 810003)

藏羚羊俗稱獨(dú)角羊，青藏高原土生物種，屬偶蹄目、?？?、藏羚屬，系青藏高原特有物種，主要分布在西藏和青海的大部分以及新疆南緣、四川西北隅和甘南西南的部分地區(qū)。它們的棲息高度在3700m～5500m，尤以4500m～5500m的高原無(wú)人區(qū)比較常見(jiàn)，如高寒草甸、高寒草原和高寒荒漠等環(huán)境［1］。藏羚羊是長(zhǎng)期在極高海拔生活，在長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月左右的牧草枯草期，尤其是冬季，草原經(jīng)常被大雪覆蓋，導(dǎo)致藏羚羊所能獲取到的食物極其有限但就是在這樣惡劣的環(huán)境下，藏羚羊依然頑強(qiáng)的生活，這可能與它的消化和吸收能力有著密切的聯(lián)系。據(jù)曹俊虎［2］等對(duì)藏羚羊冷季干物質(zhì)的消化效率的實(shí)驗(yàn)研究表明，藏羚羊在枯草期對(duì)禾本科牧草上部(含種子)、禾本科莖桿及禾本科牧草、混合牧草干物質(zhì)的消化率分別為72.56%、65.60%和70.86%，對(duì)比趙新全［3］、劉金祥［4］、Merkel［5］等多人在野生藏綿羊、高山草原放牧綿羊、公山羊等反芻動(dòng)物對(duì)干物質(zhì)的消化率的研究，發(fā)現(xiàn)藏羚羊冬季對(duì)牧草的消化率比以上研究所測(cè)得對(duì)干物質(zhì)的消化率(40% ～64%)相對(duì)較高，這表明在嚴(yán)酷的生境下，藏羚羊通過(guò)對(duì)牧草干物質(zhì)較高的消化率為其生存提供了一定的條件。消化道是脊椎動(dòng)物體內(nèi)最大、最復(fù)雜的內(nèi)分泌器官［6］。嗜銀細(xì)胞屬于內(nèi)分泌細(xì)胞，其主要分泌5－羥色胺(5－HT)［7］，它具有刺激平滑肌收縮、血管擴(kuò)張及調(diào)節(jié)胃腸消化的功能。那么，藏羚羊在高寒低氧、食物匱乏的環(huán)境中能夠生存，其消化系統(tǒng)尤其是調(diào)節(jié)小腸消化功能的嗜銀細(xì)胞有何特征呢?為了保護(hù)和發(fā)展這一世界珍稀物種，本實(shí)驗(yàn)采用組織化學(xué)的方法對(duì)藏羚羊和生活在同一海拔高度的藏綿羊的小腸嗜銀細(xì)胞的分布和數(shù)量進(jìn)行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的取材和固定

經(jīng)國(guó)家林業(yè)局批準(zhǔn)(林護(hù)批字［2009］194號(hào))，在青海省可可西里自然保護(hù)區(qū)(海拔4 300 m)捕捉健康藏羚羊和藏綿羊各5只，頸總動(dòng)脈采血后放血處死，就地迅速解剖，取十二指腸、空腸和回腸中段各2 cm左右快速置入4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH7.4)固定液，搖勻，固定48 h。

1.2 石蠟切片制作

1.2.1 脫水透明包埋:固定好的組織分別依次經(jīng)過(guò)50%酒精24 h→70%酒精24 h→80%酒精18 h→95%酒精18 h→100%酒精6 h→酒精﹕二甲苯1 h→二甲苯I 10～20 min(二甲苯的時(shí)間長(zhǎng)短不同，組織變透亮為宜)→二甲苯﹕蠟30 min→蠟Ⅰ30 min→蠟Ⅱ30 min。包埋時(shí)先預(yù)熱鋁板、鋁條、鑷子等工具，先倒蠟后放組織。

1.2.2 切片:制作橫斷面連續(xù)切片，每隔10張取1張，片厚 3 μm。

1.3 硝酸銀染色

1.3.1 試劑的配制:(1)1%硝酸銀水溶液:硝酸銀0.1 g，加入10 mL雙蒸水，混合均勻即可。(2)0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液的配制:A液:99% ～100%冰醋酸(比重:1.050～1.054)2.875 mL，加蒸餾水至 250 mL。B 液:醋酸鈉 6.8 g，加蒸餾水至250 mL。A液B液混合即可得0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液。(3)硝酸銀液:取1%硝酸銀水溶液3 mL，0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液的配制10 mL，加雙蒸水至100 mL混勻。(4)還原液:對(duì)苯二酚1 g，亞硫酸鈉2.5 g，加水至100 mL。

1.3.2 染色步驟:切片按常規(guī)脫蠟、復(fù)水，然后放入60℃硝酸銀液4 h，雙蒸水洗2次，放入45℃還原液35 min，蒸流水洗3次洗去多余的染液，放入5%硫代硫酸鈉2 min，雙蒸水洗2次，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

光鏡下觀察嗜銀細(xì)胞的形態(tài)分布;嗜銀細(xì)胞的計(jì)數(shù)是每只動(dòng)物各段小腸分別統(tǒng)計(jì)5張切片橫斷面全層的嗜銀細(xì)胞數(shù)，并用Moditec照相處理軟件，計(jì)算單位面積內(nèi)的嗜銀細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS.V13.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 藏羚羊與藏綿羊小腸嗜銀細(xì)胞的形態(tài)與分布

嗜銀細(xì)胞經(jīng)Grimelins染色后，細(xì)胞質(zhì)被染成棕褐色，細(xì)胞核不著色，胞漿內(nèi)顆粒豐富。細(xì)胞形態(tài)有梭形、蝌蚪形、圓形和不規(guī)則形，主要分布在黏膜層，尤其在靠近黏膜肌的小腸腺上皮之間，絨毛上皮之間和絨毛軸心中也有零星分布。并且藏羚羊嗜銀細(xì)胞在回腸最多，十二指腸次之，空腸較少，藏綿羊嗜銀細(xì)胞在十二指腸最多，回腸次之，空腸較少。

圖1 藏羚羊(A)和藏綿羊(B)十二指腸的嗜銀細(xì)胞(箭頭所示)Grimelins染色40×

2.2 藏羚羊與藏綿羊小腸嗜銀細(xì)胞的數(shù)量

由下表可知，藏羚羊小腸的嗜銀細(xì)胞數(shù)少于藏綿羊小腸的嗜銀細(xì)胞數(shù)(P＞0.05)，其中藏羚羊十二指腸的嗜銀細(xì)胞數(shù)量比藏綿羊的減少38.38%(P ＜0.05)，而藏羚羊空腸和回腸的嗜銀細(xì)胞數(shù)比藏綿羊空腸和回腸的多31.76%(P ＞0.05)，12.93%(P ＞0.05)。

同一物種不同腸段的嗜銀細(xì)胞數(shù)量比較，藏羚羊嗜銀細(xì)胞數(shù)量在回腸最多，十二指腸次之，空腸最少，其中回腸分別較十二指腸、空腸的多 32.36%(P ＜0.05)、43.11%(P ＜0.05)，十二指腸與空腸間差異不顯著(P ＞0.05)。藏綿羊嗜銀細(xì)胞數(shù)在十二指腸最多，回腸次之，空腸較少，其中十二脂腸分別較空腸、回腸的多131.22%(P ＜0.05)、38.48%(P ＞0.05)。

表1 藏羚羊和藏綿羊小腸嗜銀細(xì)胞的數(shù)量 (cells/mm2)

圖2 藏羚羊與藏綿羊小腸嗜銀細(xì)胞數(shù)量的比較

3 討論

嗜銀細(xì)胞是消化道內(nèi)的一類內(nèi)分泌細(xì)胞，主要分泌5－HT，5－HT能刺激胃腸黏膜分泌，平滑肌收縮和血管擴(kuò)張，對(duì)消化功能有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)功能。5－HT在5－HT受體的介導(dǎo)下刺激初級(jí)傳入神經(jīng)元，然后該神經(jīng)元與肌間神經(jīng)叢中與上行、下行中間神經(jīng)元形成突觸，從而產(chǎn)生局部的興奮和抑制作用。上行性中間神經(jīng)元通過(guò)釋放P物質(zhì)和乙酰膽堿作用于興奮性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，引起環(huán)行肌收縮;下行性中間神經(jīng)元通過(guò)釋放5－HT、血管活性腸肽、生長(zhǎng)抑素、速激肽、一氧化氮、血管活性腸肽等神經(jīng)遞質(zhì)作用于抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元而使環(huán)行肌松弛。由此形成了胃腸道由近端向遠(yuǎn)端的蠕動(dòng)反射［8］。腸道的運(yùn)動(dòng)與其內(nèi)容物的傳輸密切相關(guān)。腸道的蠕動(dòng)速度快，則對(duì)腸內(nèi)容物的傳輸速度也快，反之則慢。有研究發(fā)現(xiàn)［9］，在靜脈內(nèi)注射5－HT或給予選擇性5－HT再攝取抑制劑后，小腸蠕動(dòng)增強(qiáng)，推進(jìn)速度加快，內(nèi)容物通過(guò)回盲部的時(shí)間縮短;給予大鼠腹膜內(nèi)注射5－HT能顯著增強(qiáng)其結(jié)腸的推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)，使腸內(nèi)容物由近端向遠(yuǎn)端結(jié)腸移動(dòng)，快速至直腸排出，甚至可以導(dǎo)致腹瀉。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，藏羚羊小腸內(nèi)嗜銀細(xì)胞數(shù)量少于藏綿羊，尤其是十二指腸的嗜銀細(xì)胞數(shù)量顯著少于藏綿羊，較少的嗜銀細(xì)胞使得其分泌少量的5－TH，后者所激活的一級(jí)神經(jīng)元數(shù)量少，從而導(dǎo)致小腸蠕動(dòng)較弱，腸道由近端向遠(yuǎn)端的推進(jìn)運(yùn)動(dòng)緩慢，這個(gè)過(guò)程使得藏羚羊所采的食物在小腸特別是在十二指腸的存留時(shí)間相對(duì)藏綿羊要長(zhǎng)，因此其對(duì)食物的消化時(shí)間要長(zhǎng)，消化和吸收的效率更高，這在很大程度上促進(jìn)了藏羚羊?qū)κ澄锏睦眯省?/p>

有關(guān)哺乳動(dòng)物小腸嗜銀細(xì)胞的分布形式有2種［10］，第一種:內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量在十二指腸較多，向尾端有降低的趨勢(shì)，形成一條從小腸頭端向尾端傾斜的分布密度曲線，如豬、貓、馬、豚鼠;第二種:內(nèi)分泌細(xì)胞在小腸中段數(shù)量極少，而在頭尾兩端即十二指腸和回腸數(shù)量較多，形成一個(gè)“U”形的密度分布曲線，如大鼠。本研究中藏羚羊和藏綿羊小腸嗜銀細(xì)胞的分布形式與第二種一致。

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