反相高效液相色譜法測定苜蓿中綠原酸的含量

古麗巴哈爾·達(dá)吾提 陳 娟 王 娟 買買提·吐爾遜

(喀什師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，新疆 喀什 844000)

苜蓿是苜蓿屬(Medicago)植物的通稱，是一種多年生開花植物。苜蓿原產(chǎn)伊朗，在西漢從西域引進(jìn)，已有2000多年的栽培歷史，是分布最廣的栽培牧草。苜蓿中最著名的是作為牧草的紫花苜蓿(Medicago sativa L.)。苜蓿不僅可用于家畜飼養(yǎng)，也是人類最古老的食物之一，其含有大量的粗蛋白質(zhì)、多種維生素、礦物質(zhì)及類黃酮素成分［1］。在新疆用苜蓿做的餛飩是春天里的第一道美食。維吾爾等少數(shù)民族有一個(gè)風(fēng)俗，不管是城市還是農(nóng)村，開春后每家每戶都要吃用苜蓿包的餛飩。迎接春天的到來，蘊(yùn)含報(bào)春之意。吃苜蓿餛飩已成為新疆各族群眾普遍喜好的春季美食之一，主要食用苜蓿早春返青時(shí)的嫩苜蓿。除此之外，維醫(yī)使用苜蓿嫩葉治療腸胃道功能失調(diào)，改善糖尿病、高血壓等慢性病。隨著人民生活水平的提高，綠色食品越來越受到廣大群眾的青睞。由于苜蓿中富有各種營養(yǎng)成分，已成為新疆各族群眾在春季里的美食。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，已開發(fā)出了以苜蓿為原料的食品添加劑和飲料［2］。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜－二極管陣列檢測法，對苜蓿中的綠原酸進(jìn)行含量測定，為苜蓿的質(zhì)量評價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC－20AT高效液相色譜儀(配有SPD－M20A二極管陣列檢測器，DGU－20A5在線脫氣機(jī)，LC－solution工作站);KQ3200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XA－1型多功能粉碎機(jī)(江蘇姜堰市分析儀器廠);ZK－82B真空干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠);賽多利斯BS224S型電子天平(德國)。

綠原酸對照品(編號(hào):110753－200413，中國藥品生物制品檢定所)，甲醇、乙腈為色譜純，水為高純水其它試劑均為分析純。苜蓿嫩草，2013年分2月分別采集于喀什地區(qū)疏附縣，疏勒縣。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液:準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，置于50mL容量瓶中加甲醇制成每1mL含綠原酸100μg的貯備溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液:取新鮮苜蓿樣品用去離子水洗凈，置于真空干燥箱內(nèi)，在80℃下真空干燥8h，經(jīng)粉碎后精密稱取2.0g，用甲醇分兩次超聲處理40min，常壓過濾，取濾液置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中用甲醇定容。

2.2 色譜條件:色譜柱為安捷倫HC－C18柱(250mm×4.6mm，5?μm)柱，流動(dòng)相為乙腈 －0.4%磷酸=13:87(V/V)，流速為 1.0mL/min，檢測波長為 327nm［4］，進(jìn)樣量為 20μL。在本文色譜條件下，取供試品溶液、綠原酸對照品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖A，B)。

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn):精密吸取對照品溶液 0.5，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL 分別置于50mL(1 支)，10mL(5 支)容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。吸取各對照品溶液20μL，在上述色譜條件下依次進(jìn)樣，測定峰面積。以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:Y=21036X+4821.8，r=0.9997，線性范圍為 1.0 ～40μg·mL－1。

2.4 精密度試驗(yàn):精密吸取對照品溶液1.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。精密吸取對照品液20μL，照2.2項(xiàng)下進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，對照品綠原酸峰面積的RSD=1.02%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn):取樣品溶液，分別在 0，2，4，6，8h 在上述色譜條件下測一次，進(jìn)樣量為20μL，結(jié)果綠原酸的峰面積的RSD=0.98%。表明樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取苜蓿粉末2.0g，按上述供試品溶液的制備方法和測定條件，重復(fù)測定5份，結(jié)果綠原酸峰面積的RSD=1.21%。

2.7 回收率試驗(yàn):準(zhǔn)確稱取已知綠原酸含量的苜蓿粉末2.0g(5 份)，精密稱定，分別精密加入 20μg·mL－1對照品溶液1mL，按供試品溶液制備和測定方法檢測，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測定結(jié)果:精密吸取苜蓿樣品溶液20μL進(jìn)樣，并按1.2色譜條件進(jìn)行平行5次測定，外標(biāo)法計(jì)算樣品中綠原酸的含量。測定結(jié)果為9.2mg%(n=5，RSD=1.05%)。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品及苜蓿樣品HPLC色譜圖。

3 討論

苜蓿作為牧草作物當(dāng)中營養(yǎng)價(jià)值最高的一種草本植物，在少數(shù)民族飲食文化及維醫(yī)中具有特殊地位。苜蓿嫩葉化學(xué)成分較復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)采用浸泡、索氏提取、超聲等提取方法對綠原酸進(jìn)行提取，通過色譜數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，浸泡4h后，分2次超聲40min可以得到較好的提取效率，即峰面積最大［3］。本實(shí)驗(yàn)以不同比例的甲醇/乙酸、甲醇/磷酸、乙腈/乙酸、乙腈/0.4%磷酸作為流動(dòng)相，最后確定用乙腈/0.4%磷酸(13:87)為流動(dòng)相，在此條件下，樣品溶液中的綠原酸達(dá)到了較好的分離效果。本實(shí)驗(yàn)所使用的儀器配有二極管陣列檢測器，因此，根據(jù)色譜三維圖可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)波長為327nm時(shí)，峰型較好，并且干擾組分的峰面積減小，綠原酸的色譜峰可以避免其他成分色譜峰的干擾［4，5］。通過實(shí)驗(yàn)得出苜蓿嫩葉中綠原酸的含量為9.2mg%。同時(shí)采用的方法簡單，提取效率高，為苜蓿中綠原酸的提取和含量測定提供了一種簡便快捷手段。

［1］王艷萍，祝美云，王成章，等.苜蓿在食品中的應(yīng)用［J］.食品研究與開發(fā)，2006.27(3):73－75

［2］喬秀紅.苜蓿汁飲料的研制［J］.中國食物與營養(yǎng)，2002，4:41 －42

［3］林丹，趙國玲，劉佳佳.金銀花不同提取方法的綠原酸比較研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，15(2):124－126

［4］李存滿，李蘭芳，張勤增.高效液相色譜法測定苜蓿中莒蓿素的含量［J］.藥物分析雜志，2006，26(4):494－496

［5］趙英，周凱，張靜.HPLC法測定牛蒡子中綠原酸的含量［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2012，9:44－46