在線凝膠滲透色譜/氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測定水果中11種苯氧羧酸類農(nóng)藥

張 帆，付善良，施雅梅，李忠海，張 瑩，王美玲，顏鴻飛，黃志強*

(1.長沙環(huán)境保護職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004;2.食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，湖南 長沙 410004;3.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004;4.廈門出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，福建 廈門 361026)

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的現(xiàn)代化，世界上第二大選擇性激素類除草劑苯氧羧酸類農(nóng)藥憑借其高效、內(nèi)吸、高度選擇性的特點廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。這類農(nóng)藥常被用于農(nóng)作物中闊葉雜草的防治以及用作生長調(diào)節(jié)劑和水果保鮮劑［1－2］。研究表明，經(jīng)苯氧羧酸類農(nóng)藥處理過的植物容易蓄積濃度很高的硝酸鹽或氰化物等干擾內(nèi)分泌的代謝產(chǎn)物，對人類和生物造成一定的危害［3－4］。

目前，國內(nèi)外有關(guān)苯氧羧酸類農(nóng)藥多殘留檢測的文獻報道多集中在土壤和水體等環(huán)境樣品［5－7］，而其在食品中殘留量的檢測報道很少，且主要集中于糧谷類農(nóng)作物［8－10］。已有的苯氧羧酸類農(nóng)藥的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法及液質(zhì)聯(lián)用法，前兩者需以三氟化硼衍生，操作繁瑣且毒性較大;后兩者雖不需要衍生，但液相的檢測靈敏度較低，液質(zhì)聯(lián)用儀則價格較為昂貴。凝膠滲透色譜凈化技術(shù)能有效地去除樣品基質(zhì)中的色素等干擾雜質(zhì)，但常規(guī)的凝膠滲透色譜多采用離線方式，樣品處理時間長、溶劑消耗大、操作繁瑣。本文采用在線凝膠色譜/氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合大體積進樣，同時對水果中的11種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留進行分析，實現(xiàn)了從樣品前處理到農(nóng)藥分析的自動化，為打破農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易技術(shù)壁壘，促進水果外貿(mào)出口以及有效地保障水果的食用安全提供了科學(xué)數(shù)據(jù)［11－15］。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

在線凝膠滲透色譜/氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(GPC/GC－MS)，配有程序升溫(PTV)進樣口和電子轟擊離子(EI)源(日本島津公司)。農(nóng)藥標準品(Dr.Ehrenstorfer Co.，Germany);正己烷、丙酮、環(huán)己烷、正丁醇(色譜純，美國Tedia公司);無水硫酸鈉、濃硫酸(分析純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司);農(nóng)藥標準品:用丙酮配成標準儲備液(100 mg/L)，根據(jù)檢測要求用流動相稀釋成相應(yīng)的標準工作溶液。實驗用水為超純水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取取5 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入2 mL 6 mol/L的鹽酸及2 mL丙酮于旋渦混合器上振蕩3 min，然后加入4 mL正己烷超聲提取15 min，離心3 min(6 500 r/min)后，將上層有機相清液轉(zhuǎn)移至另一支玻璃刻度試管中，下層殘渣用正己烷(每次4 mL)重復(fù)提取2次，合并提取液，于40℃下氮氣吹干。

1.2.2 衍生向上述玻璃刻度試管中加160 μL正丁醇、40 μL濃硫酸，加塞混勻后于80℃下放置50 min進行丁酯化衍生反應(yīng)。每次用2 mL正己烷重復(fù)提取3次，合并提取液，在氮氣吹干儀上濃縮至約1 mL，待過柱凈化。

1.2.3 凈化在Florisil固相萃取柱中加入約1 cm高的無水硫酸鈉，用丙酮－正己烷混合溶液(1∶9)活化柱后，將樣品的酯化液上樣，用丙酮－正己烷混合溶液(1∶9)淋洗，以1 mL/min的速度收集5 mL，取1 mL洗脫液用氮氣吹至近干，用流動相丙酮－環(huán)己烷溶液(3∶7)定容至1 mL，供在線GPC/GC－MS測定。

1.3 分析條件

GPC條件:Shodex EV200凝膠滲透色譜柱(2 mm×150 mm);流動相為丙酮－環(huán)己烷溶液(3∶7)，流速0.1 mL/min;進樣量10 μL。

色譜條件:色譜柱為惰性熔融石英毛細管柱(5 m×0.53 mm);DB-5MS預(yù)柱(5 m×0.25 mm×0.25 μm);DB-5MS分析柱(25 m×0.25 mm×0.25 μm);柱溫:82℃(保留5 min)，以15℃/min升至200℃，再以30℃/min升至300℃(恒溫5 min);進樣口:PTV進樣口;進樣口溫度:120℃(保留5 min)，再以100℃/min升至250℃(恒溫15 min);不分流進樣;載氣為高純氦氣，流量為1.75 mL/min。

質(zhì)譜條件:離子化方式:電子轟擊電離源(EI)，電離能量:70 eV;傳輸線溫度:250℃;離子源溫度:200℃;溶劑延遲9.7 min;掃描方式:選擇離子監(jiān)測模式(SIM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)水果基質(zhì)含色素多的特點和檢測的目標化合物為強極性酸性化合物的物理化學(xué)性質(zhì)，本實驗分別選用丙酮－正己烷、丙酮－乙酸乙酯和丙酮－乙醚3種混合溶劑提取，丙酮只在第1次提取時加入2 mL。發(fā)現(xiàn)3種混合溶劑的提取效率相當，但丙酮－乙酸乙酯和丙酮－乙醚提取出的雜質(zhì)相對較多?？紤]到乙醚的易揮發(fā)性和對人體的麻醉性，不宜作提取溶劑。而乙酸乙酯的沸點相對較高，氮氣吹干所需的時間很長，且浪費氮氣。故本實驗選用丙酮－正己烷作提取溶劑。

2.2 酸度對農(nóng)藥提取效率的影響

由于苯氧羧酸類農(nóng)藥是有機酸，在酸性條件下保持穩(wěn)定并易被提取，實驗中用鹽酸將樣品溶液調(diào)成不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)后進行提取。數(shù)據(jù)顯示，11種苯氧羧酸類農(nóng)藥的回收率受酸度影響較顯著，pH 2.0～3.0時，大部分農(nóng)藥的回收率集中在80%～100%之間。因此，為了保證農(nóng)藥的回收率，應(yīng)盡量保證樣品溶液的pH值在2.0～3.0之間。

圖1 11種苯氧羧酸類農(nóng)藥混合標準品(0.1 mg/L)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of 11 phenoxy acid pesticides standards mixture(0.1 mg/L)

2.3 衍生條件的選擇

苯氧羧酸類農(nóng)藥具有羧羥基，極性較強，需要通過衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化為弱極性、易揮發(fā)的化合物來進行分析。參考標準和文獻方法［10，16］，分別采用三氟化硼甲醇溶液(5 mL)、三氟化硼丁醇溶液(5 mL)在70℃水浴中進行衍生反應(yīng)，正丁醇－硫酸(4∶1)作為衍生化試劑在室溫下進行衍生反應(yīng)。結(jié)果表明，這3種方法的衍生效率無明顯差別。由于三氟化硼毒性很大，需在水浴加熱環(huán)境中進行反應(yīng)，且衍生操作繁瑣。而正丁醇－硫酸的衍生效率較高，丁酯化過程中產(chǎn)生的干擾物質(zhì)較少，操作較為簡便，因而最終選擇正丁醇－硫酸(4∶1)作為衍生試劑。

為了進一步提高衍生效率，考察了不同衍生時間(10、20、30、40、50、60 min)及衍生溫度(室溫、30、40、50、60、70、80℃)對衍生反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，11種苯氧羧酸類農(nóng)藥的衍生化反應(yīng)在40 min時達到峰值，隨著時間的延長，峰值無明顯變化，為了確保衍生反應(yīng)完全，選擇衍生化反應(yīng)時間為50 min。另外，目標化合物的回收率隨著衍生溫度的升高而升高，70℃后其回收率無明顯變化，為了保證農(nóng)藥的回收率，本實驗選取80℃作為最佳衍生反應(yīng)溫度。圖1為優(yōu)化條件下11種苯氧羧酸類農(nóng)藥衍生物(0.1 mg/L)的標準色譜圖。

2.4 固相萃取條件的選擇

比較了C18柱、Florisil柱、Si柱和NH2柱4種固相萃取柱的凈化效果，發(fā)現(xiàn)C18柱的凈化效果不理想，譜圖中的雜質(zhì)峰干擾較大;Si柱和NH2柱的回收率較低，并且不能將11種苯氧羧酸類農(nóng)藥完全洗脫;而經(jīng)Florisil柱凈化后，可有效地去除色素等雜質(zhì)，在色譜圖中干擾最小，回收率結(jié)果也符合標準要求，因此選定Florisil柱為凈化載體。

2.5 在線GPC凈化

由于水果中含有大量色素和少量油脂，從而增加了凈化的難度。樣品在進入質(zhì)譜分析前通過在線GPC的進一步凈化，可以大大減少進入GC－MS系統(tǒng)的大分子干擾物質(zhì)，使基質(zhì)干擾的問題得到解決，同時取代了經(jīng)典的GPC凈化方式，縮短了分析過程，從而實現(xiàn)了從樣品凈化到分析檢測的自動化，減少了人工操作帶來的分析偏差，并提高了實驗室的工作效率。另外采用2 mm內(nèi)徑的GPC微型柱，消耗的有機溶劑大大減少，降低了溶劑對人和環(huán)境產(chǎn)生的影響。圖2為經(jīng)凈化后的蘋果樣品空白及添加了11種苯氧羧酸類農(nóng)藥的加標蘋果樣品的色譜圖。

2.6 線性關(guān)系與檢出限

用GPC流動相丙酮－環(huán)己烷溶液(3∶7)配制系列標準工作溶液，在“1.3”分析條件下進行測定。以農(nóng)藥選擇離子的峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X，mg/L)作圖，求得線性方程和相關(guān)系數(shù)(見表1)。11種化合物在0.01～1.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不低于0.998 7。以10倍信噪比計算得11種苯氧羧酸類農(nóng)藥的定量下限為7～10 μg/kg。

圖2 蘋果空白(A)及添加0.1 mg/kg混合標準品蘋果樣品(B)的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank apple sample(A)and apple sample spiked with 0.1 mg/kg phenoxy acid pesticide standards mixture(B)the numbers denoted were the same as those in Fig.1

表1 11種苯氧羧酸類農(nóng)藥的保留時間、定量定性離子、線性關(guān)系及定量下限Table 1 Retention times，quantitative ions，qualitative ions，linear relationships and quantitation limits of 11 phenoxy acid pesticides

2.7 回收率與精密度

在優(yōu)化條件下對11種苯氧羧酸類農(nóng)藥在蘋果、香蕉和柑橘3種水果中進行3個水平的加標回收實驗，每個加標水平平行6次，回收率和相對標準偏差如表2所示。由表可見，3個加標水平下的回收率為66%～112%，相對標準偏差(RSD)為3.4%～11.5%，方法的準確度及精密度可滿足水果中11種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留的檢測要求。

表2 蘋果、香蕉和柑橘中11種苯氧羧酸類農(nóng)藥的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of 11 phenoxy acid pesticides in apple，banana and orange samples at three spiked levels(n=6)

(續(xù)表2)

2.8 實際樣品的檢測

為了驗證本方法的可行性，從市場購買了香蕉和柑橘樣品，按照所建立的方法進行處理并測定其中苯氧羧酸類農(nóng)藥的殘留量。結(jié)果在柑橘樣品中11種苯氧羧酸類農(nóng)藥均有檢出;香蕉樣品中檢出2，4-D，含量為0.058 mg/kg，其他農(nóng)藥成分均未檢出。

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