超高壓輔助離子液體提取/HPLC分析牛蒡子中牛蒡苷與牛蒡苷元

王 迪，耿巖玲，王 曉，劉建華，劉代成，劉 峰*

(1.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014;2.山東省科學(xué)院山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014)

牛蒡子為菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果實(shí)，具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹，解毒利咽的功效，用于治療風(fēng)熱感冒、咳嗽痰多、麻疹、風(fēng)疹、咽喉腫痛等癥［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，牛蒡子具有抗腫瘤、抗菌、降血糖等功能［2－4］。牛蒡子含有豐富的木脂素類化合物、亞油酸、亞麻酸、揮發(fā)油等成分。其中，以牛蒡苷的含量最高，牛蒡苷經(jīng)水解生成牛蒡苷元［5］。牛蒡苷和牛蒡苷元具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)［6］、抗病毒［7］、抗腫瘤［8］、治療腎?。?］等多種藥理作用。

目前，從牛蒡子中提取牛蒡苷和牛蒡苷元主要采用加熱回流法［10］、超臨界萃取法［11］和超聲波輔助提取法［12］。超高壓提取技術(shù)應(yīng)用于中藥有效成分提取時(shí)，是利用100 MPa以上的流體靜壓力作用于溶劑和中藥的混合液，保壓數(shù)分鐘后泄壓，然后進(jìn)行分離純化，從而達(dá)到提取的目的［13］。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，超高壓提取可以大大縮短提取時(shí)間、降低能耗、減少雜質(zhì)成分的溶出，提高有效成分的收率，避免了因熱效應(yīng)引起的有效成分結(jié)構(gòu)變化、損失以及生理活性的降低［14］。同時(shí)超高壓提取在密閉的環(huán)境中進(jìn)行，沒有溶劑的揮發(fā)，因此該技術(shù)更加符合綠色環(huán)保的要求［15］。目前超高壓提取技術(shù)已在茶葉中提取茶多酚［16］、甜葉菊中提取甜菊糖甙［17］、金銀花中提取總黃酮［18］、大豆中提取大豆卵磷脂［19］等多種植物有效成分的提取中獲得應(yīng)用。離子液體是指全部由離子組成的液體，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，離子液體是一種環(huán)境友好溶劑，具有溫度區(qū)間大、溶解范圍廣、化學(xué)和熱穩(wěn)定性好，且?guī)缀鯖]有蒸汽壓，同時(shí)具有不揮發(fā)、不易燃燒和爆炸等優(yōu)點(diǎn)。

本文以離子液體為溶劑，采用超高壓提取技術(shù)從牛蒡子中提取牛蒡苷和牛蒡苷元，通過對(duì)離子液體類型、濃度、提取壓力、時(shí)間、料液比等單因進(jìn)行素實(shí)驗(yàn)確定了提取工藝條件，以期為綜合利用牛蒡子資源，開發(fā)牛蒡苷和牛蒡苷元活性成分提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

牛蒡子購(gòu)于山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯醫(yī)院，經(jīng)山東省分析測(cè)試中心王曉研究員鑒定為牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果實(shí)。牛蒡苷、牛蒡苷元對(duì)照品(純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司);乙醇、甲醇為分析純(濟(jì)南巨業(yè)化學(xué)試劑有限公司);1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-己基-3-甲基咪唑四氟磷酸鹽、氯化1-己基-3-甲基咪唑、溴化1-己基-3-甲基咪唑、溴化1-辛基-3-甲基咪唑、溴化1-癸基-3-甲基咪唑、溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑(CnmimX，純度為99%，上海成捷化學(xué)有限公司);HPLC分析用乙腈為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP·L3-600型超高壓生物提取設(shè)備(天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司);Agilent 1120型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);SB-5200D型超聲波提取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 將干燥后的牛蒡子用中藥粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。得到粉末狀樣品，放置于干燥處備用。

1.3.2 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱(4.0 mm×150 mm，5 μm);流動(dòng)相A為乙腈，B為0.10%磷酸溶液;梯度洗脫程序:0～20 min，25%～55%A;20～21 min，55%～100%A;21～30 min，100%A;流速1 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.3.3 超高壓提取(UPE) 稱取樣品0.50 g，轉(zhuǎn)入聚乙烯塑料袋中，按照一定的料液比加入不同溶劑，密封。在室溫(25℃)下浸泡4 h后，在一定壓力下，提取一定時(shí)間，泄壓。提取液用0.45 μm微濾膜過濾，乙醇定容至50 mL后HPLC測(cè)定含量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 超聲提取(UAE) 稱取樣品1.0 g，分別加入甲醇、乙醇、0.8 mol/L的C12mimBr溶液各20 mL，在室溫下浸泡4 h后，于超聲頻率30 kHz下，提取30 min。提取液用0.45 μm微濾膜過濾，乙醇定容至50 mL后HPLC測(cè)定含量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 加熱回流提取(HRE) 稱取樣品1.0 g，加入甲醇、乙醇、0.8 mol/L的C12mimBr溶液各20 mL，在室溫下浸泡4 h后，分別于60、80、100℃下提取2 h。提取液用0.45 μm微濾膜過濾，乙醇定容至50 mL后HPLC測(cè)定含量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體條件的優(yōu)化

2.1.1 離子液體類型對(duì)提取率的影響 分別采用1.0 mol/L的C4mimPF6、C4mimBF4、C4mimCl、C4mimBr溶液為提取溶劑，固定料液比1∶20(g/mL)，在壓力200 MPa下浸提2 min，不同離子液體類型對(duì)提取率的影響如圖1所示。由圖1可知，C4mimBr溶液更顯優(yōu)勢(shì)，其對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元的提取率分別為13.11、3.84 mg/g。由此可以看出，目標(biāo)化合物的提取率與離子液體的類型有關(guān)，陰離子影響的大小關(guān)系為Br－＞

2.1.2 離子液體碳鏈長(zhǎng)度對(duì)提取率的影響 分別采用 1.0 mol/L 的 C4mimBr、C6mimBr、C8mimBr、C10mimBr、C12mimBr溶液為提取溶劑，固定料液比1∶20(g/mL)，在壓力200 MPa下浸提2 min，不同碳鏈長(zhǎng)度對(duì)提取率的影響如圖2所示。由圖2可知，離子液體的碳鏈長(zhǎng)度對(duì)提取率有很大影響，隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加，提取率隨之升高。這是因?yàn)殡S著碳鏈長(zhǎng)度的增加，離子液體的疏水性增強(qiáng)，同時(shí)，咪唑基陽離子與牛蒡苷、牛蒡苷元之間存在的π－π躍遷、氫鍵、離子化等作用可有助于目標(biāo)化合物在離子液體溶液中溶解，從而提高提取率?？紤]到離子液體陰、陽離子對(duì)提取率的影響，選取C12mimBr溶液作為目標(biāo)化合物的提取溶劑。

2.1.3 離子液體濃度對(duì)提取率的影響 分別配制0.5、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L的C12mimBr溶液，固定料液比1∶20(g/mL)，加入上述不同濃度的離子液體，在200 MPa下浸提2 min，離子液體濃度對(duì)提取率的影響如圖3所示。由圖可知，當(dāng)離子液體濃度由0.5 mol/L增至0.8 mol/L時(shí)，溶劑對(duì)目標(biāo)化合物的溶解能力和萃取能力增強(qiáng)。原因是離子液體與牛蒡子基體和木質(zhì)素化合物的相互作用增強(qiáng)，從而加速了牛蒡子中木質(zhì)素類化合物的萃取和水解，提高了牛蒡苷和牛蒡苷元的提取率。而當(dāng)離子液體濃度繼續(xù)增大時(shí)，提取率明顯降低，這是因?yàn)殡S著離子液體濃度的增大，溶液黏度增大，擴(kuò)散能力減弱，離子液體難滲入到牛蒡子樣品基質(zhì)內(nèi)部，導(dǎo)致提取率降低。因此，選擇0.8 mol/L的C12mimBr溶液為最佳提取溶劑。

圖1 離子液體類型對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of ionic liquid type on the extraction yield

圖2 不同碳鏈長(zhǎng)度離子液體對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of carbon chain length on the extraction yield

2.2 提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 提取壓力對(duì)提取率的影響 以0.8 mol/L的C12mimBr溶液為溶劑，選擇料液比1∶20(g/mL)，分別在100、200、300、400、500 MPa高壓下浸提2 min，提取結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，隨著超高壓壓力的升高，提取率隨之提高，達(dá)到200 MPa后，再增加壓力，提取率基本不變。在200 MPa以下，隨著壓力的升高，有效成分的傳質(zhì)速率加快，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞的數(shù)量增加，因此提取率隨壓力的增加而提高，壓力大于200 MPa時(shí)，細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被充分破壞，目標(biāo)化合物已充分溶出，此時(shí)再提高壓力，對(duì)提取率影響不大。

圖3 不同濃度C12mimBr對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of C12mimBr concentration on the extraction yield

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 以0.8 mol/L的C12mimBr溶液為溶劑，料液比1∶20(g/mL)，200 MPa高壓下分別浸提1、2、3、4、5 min，提取結(jié)果顯示，在前2 min，牛蒡苷和牛蒡苷元的提取率隨提取時(shí)間的增加而增加，超過2 min后，提取率基本不隨提取時(shí)間而變化。由于超高壓提取的過程是先對(duì)物料加壓，保持一定時(shí)間后突然泄壓，在增壓過程中，細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)超高壓差，溶劑在壓力作用下迅速滲透到細(xì)胞內(nèi);卸壓過程中壓力由幾百兆帕迅速降為常壓，同樣，在內(nèi)外壓差作用下，有效成分從細(xì)胞內(nèi)向周圍溶劑內(nèi)擴(kuò)散，從而大大加快了有效成分向外擴(kuò)散的速率。200 MPa高壓下牛蒡子的細(xì)胞破裂很快，2 min內(nèi)已充分破裂，此時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)提取率影響不大。

2.2.3 料液比對(duì)提取率的影響 以0.8 mol/L的C12mimBr溶液為溶劑，在200 MPa高壓下浸提2 min，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30(g/mL)時(shí)的提取結(jié)果見圖5。由圖5看出，當(dāng)料液比在1∶5～1∶30范圍內(nèi)時(shí)，隨著加入的溶劑量增加，提取率增加，當(dāng)料液比超過1∶20時(shí)，提取率增加緩慢，趨于穩(wěn)定。考慮到成本費(fèi)用等因素，選取最佳料液比為1∶20。

圖4 提取壓力對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction pressure on the yield of arctiin and arctigenin

2.3 最佳提取條件

綜上所述，超高壓輔助離子液體提取牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷元的最佳工藝條件為:0.8 mol/L的C12mim Br為溶劑，提取壓力200 MPa，料液比1∶20(g/mL)，提取時(shí)間2 min，此時(shí)得到牛蒡苷和牛蒡苷元的提取率分別為37.15 mg/g和8.04 mg/g，圖6為對(duì)照品和牛蒡子樣品的色譜圖。將提取樣品量增至20 g，按照上述條件進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，牛蒡苷和牛蒡苷元的平均提取率分別為36.99 mg/g和7.86 mg/g，比樣品量小時(shí)的提取效率略低。

圖5 料液比對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of solid solvent ratio on the extraction yield

2.4 超高壓提取與其他提取方法的比較

分別采用超高壓、超聲和加熱回流方法進(jìn)行提取，并采用不同的溶劑，比較提取率和提取時(shí)間，結(jié)果如表1所示。在相同提取方法下，0.8 mol/L C12mimBr的提取效果明顯高于乙醇，而略低于甲醇，但離子液體環(huán)境友好、無污染，作為提取溶劑有明顯的優(yōu)越性。

在相同溶劑條件下，超高壓的提取率均明顯高于超聲10 min以及加熱回流30 min條件下的提取率;而當(dāng)超聲時(shí)間為30 min或加熱回流120 min時(shí)，超高壓的提取率略低于超聲和加熱回流方法。但超高壓提取時(shí)間只有2 min，是超聲方法的1/15，加熱回流方法的1/60，極大地節(jié)省了提取時(shí)間，提高了工作效率。因此，超高壓輔助離子液體提取牛蒡子中的牛蒡苷和牛蒡苷元能在極短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的提取率，是一種高效、環(huán)保的提取方法。

圖6 對(duì)照品(A)及牛蒡子樣品(B)的HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatograms of arctiin and arctigenin standards(A)and Fructus Arctii sample(B)

2.5 精密度與回收率

在優(yōu)化條件下測(cè)得牛蒡苷的線性范圍為0.010 68～0.534 μg，其回歸方程為:Y=507 699+9.118 32×109X，r2=0.999 9;牛蒡苷元的線性范圍為0.007 44～0.372 μg，其回歸方程為:Y=881 389+1.510 31 ×1010X，r2=0.999 9。

將牛蒡苷、牛蒡苷元濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品按照優(yōu)化的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3次，其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.8%和2.0%，表明方法的精密度良好。

同一份牛蒡子粉碎樣品，取等量3份，分別加入10 mg/L的牛蒡苷、牛蒡苷元混合標(biāo)準(zhǔn)樣品1 mL，按照本方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率(n=3)。結(jié)果表明，牛蒡苷、牛蒡苷元的平均回收率分別為93%和90%，RSD分別為2.2%和3.9%。

表1 不同提取方法對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元提取率的比較Table 1 Comparison of ILUPE with other extraction methods

3 結(jié)論

本文利用超高壓輔助離子液體從牛蒡子中有效提取了牛蒡苷和牛蒡苷元。與傳統(tǒng)方法相比，超高壓方法的提取時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，能耗低。同時(shí)，超高壓處理后的提取液成分較簡(jiǎn)單，不渾濁，粘度低，易過濾，有利于后續(xù)操作。此外，超高壓方法所采用的常溫提取能使牛蒡苷和牛蒡苷元避免因熱效應(yīng)而造成的損失和藥理活性降低，且該技術(shù)在密閉的常溫環(huán)境下進(jìn)行，無溶劑揮發(fā)，綠色環(huán)保。因此，超高壓輔助離子液體提取技術(shù)是一種提取牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷元的較好方法。

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