反反相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定植物源性食品中草甘膦及其代謝物殘留

周 爽，徐敦明，*，林立毅，陳鷺平，周 昱，楊黎忠

(1.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 廈門 361026;2.集美大學(xué) 生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

草甘膦(GLY，結(jié)構(gòu)式見圖1A)是一種常用的、兼具內(nèi)吸、傳導(dǎo)性、滅生性的除草劑，由于不具有選擇性，可有效防除多種雜草及灌木，已被廣泛用于農(nóng)田、果園、道路、林業(yè)等，是目前世界上應(yīng)用最廣、生產(chǎn)量最大的廣譜性除草劑。雖然GLY屬于低毒類的有機(jī)磷除草劑，但其不合理使用會導(dǎo)致某些農(nóng)產(chǎn)品受損(如甘蔗［1］等)，影響農(nóng)產(chǎn)品的國際貿(mào)易。此外，植物產(chǎn)品中的GLY殘留超標(biāo)，會影響消費(fèi)者食用安全，甚至致病、中毒死亡［2－3］。

不同國家(地區(qū))和相關(guān)機(jī)構(gòu)對植物(食品)中GLY的限量標(biāo)準(zhǔn)不同:國際食品法典委員會制定了GLY 28項(xiàng)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，限量范圍在0.05～500 mg之間;美國GLY共172項(xiàng)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，限量范圍在0.05～400 mg之間;歐盟GLY共340項(xiàng)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其中大豆(干)20 mg、豆類蔬菜0.1 mg等;日本GLY共205項(xiàng)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，限量在0.05～20 mg之間。中國已制定了GLY 11項(xiàng)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，限量在0.05～6.0 mg之間。

由于GLY和氨甲基膦酸(AMPA)(圖1)均為強(qiáng)極性化合物，不溶于大部分有機(jī)溶劑，既無紫外吸收，又不易揮發(fā)，因此用氣相色譜或高效液相色譜檢測往往需要借助于柱前或柱后衍生化［4－8］，其步驟繁瑣，重復(fù)性差;而采用離子色譜法時(shí)［9－11］，由于GLY保留很強(qiáng)，分離時(shí)必須采用強(qiáng)淋洗劑碳酸鈉，而其它常見陰離子保留較弱無法對GLY和其它陰離子進(jìn)行同時(shí)分析，且僅限于對水等較為單一的基體的測試。近來，用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測草甘膦及其代謝物的方法也有文獻(xiàn)報(bào)道，Chen等［12］通過離子色譜與電感耦合等離子體形成八極桿反應(yīng)池，建立了直接測定土壤中GLY及AMPA的方法，無需衍生化，但操作過程中不僅對緩沖液的pH值要求嚴(yán)格，而且需要注入氦氣;Yoshioka等［13］建立了用親水柱HILIC直接測試人體血清中GLY及AMPA的方法，由于血清基質(zhì)較為單一，經(jīng)稀釋過濾即可上機(jī)分析，前處理方法不適用于食品類復(fù)雜基質(zhì);Martins－Junior等［14］建立了直接測試黃豆和水中GLY及AMPA的方法，但其檢測低限分別為0.3、0.34 mg/kg，達(dá)不到痕量分析的要求;Hao等［15］建立了直接測試水中草甘膦及其代謝物的方法，幾乎不需前處理即可上機(jī)分析;江燕等［16］最近也研究了稻米中GLY及AMPA的測試方法，但其前處理較為復(fù)雜，分析時(shí)間長達(dá)25 min?；谏鲜龇椒ǖ木窒扌裕⒁环N快速、簡捷檢測食品中草甘膦及其代謝物的方法十分必要。本文采用去離子水提取蔬菜、水果和茶葉中的GLY及AMPA，用MAX小柱進(jìn)行凈化，同時(shí)研究了不同凈化條件、流動(dòng)相以及質(zhì)譜條件等對測定靈敏度和精密度的影響，前處理方便快捷，不需衍生，在10 min內(nèi)即可完成對草甘膦及其代謝物的檢測，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品的分析證實(shí)該方法切實(shí)可行。

圖1 GLY(A)與 AMPA(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of GLY(A)and AMPA(B)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB sciex 5000高效液相色譜－質(zhì)譜儀(美國AB公司);IKA T18 Basic均質(zhì)器(德國IKA公司);草甘膦(CAS No.1071－83－6，美國Sigma－Aldrich公司);氨甲基膦酸(CAS No.1066－51－9，美國Chem Service公司);乙腈(色譜純，美國Tedia公司)，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

分別準(zhǔn)確稱取GLY及AMPA各10 mg(精確至0.01 mg)，以水為溶劑配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃保存。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取樣品1 g(不含水)或5 g(含水)至50 mL離心管中，加入10 mL水，均質(zhì)，放置20 min后，于4 000 r/min離心5 min，取上清液，備用。

1.2.2 樣品凈化 用3 mL甲醇活化MAX小柱、氨基柱小柱、HLB小柱后，用2 mL水平衡，再加2 mL 2%氨水，棄去。將上述離心后的樣品加入小柱內(nèi)，樣品完全附著于小柱內(nèi)填充物后，加2 mL 2%氨水淋洗，棄去，再依次用2 mL甲醇、2 mL 2%鹽酸甲醇洗脫，收集上述洗脫液，氮吹至干，用1 mL水定容后，過0.2 μm濾膜，將濾液取至取樣瓶中，待用。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱:Diamond Hydride柱(150 mm×2.1 mm，4.0 μm i.d.);流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:35℃;流動(dòng)相:A為5 mmol/L乙酸銨;B為5%水－95%乙腈的乙酸銨溶液(其中乙酸銨濃度為5 mmol/L);梯度洗脫步驟為:0～3 min內(nèi)，A保持30%，3.1～7 min，A保持95%，7.1～10 min，A保持30%。

1.2.4 質(zhì)譜條件 掃描方式:電噴霧負(fù)離子(ESI－)掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;霧化氣:15 L/min;氣簾氣:12 L/min;輔助加熱氣:氮?dú)? L/min;加熱溫度:600℃;噴霧電壓:5 000 V;定量和定性離子、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 GLY和AMPA的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Parameters of MS/MS for GLY and AMPA

1.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確添加標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白樣品中使樣品中GLY濃度為0.02、0.05、0.5 mg/kg，AMPA為0.04、0.1、0.1 mg/kg，室溫渦漩振蕩5 min，備用。按“1.2”分析方法操作，測其回收率，每個(gè)濃度設(shè)6次重復(fù)，計(jì)算樣本總體標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確立

在電噴霧負(fù)離子檢測方式下對GLY和AMPA進(jìn)行一級質(zhì)譜分析Q1掃描，得到分子離子(即母離子);對分析化合物的分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子信息，即子離子(圖2);然后優(yōu)化GLY和AMPA的二級質(zhì)譜參數(shù)，以分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)為最佳，得到每種化合物的二級質(zhì)譜圖;按照二級質(zhì)譜圖提供的碎片離子信息，選擇兩種化合物的定性離子對(GLY:168.3/63.0;AMPA:110.0/62.9)和定量離子對(GLY:168.3/81.0，168.3/124.0;AMPA:110.0/78.9，110.0/81.0)。

圖2 GLY(A)和AMPA(B)的二級離子碎片掃描圖Fig.2 Mass spectra of GLY(A)and AMPA(B)in product ion scan

2.2 色譜條件的選擇

由于GLY和AMPA的強(qiáng)極性和水溶性，極難在普通反相色譜柱上保留，因此本文比較了兩種親水分離色譜柱HILIC柱和反反相色譜柱的效果。

HILIC親水色譜柱是一種可以保留和分離極性－離子化合物的色譜柱，但只能在有機(jī)相較低的條件下解決極性－離子型化合物的保留問題，而反反相色譜柱同時(shí)具有反相色譜機(jī)理和正相色譜機(jī)理，只需改變流動(dòng)相即可在反相色譜與正相水平間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，不需要從流動(dòng)相中完全去除水;使用100%水相洗脫也不會產(chǎn)生柱子崩塌;1 min內(nèi)可以完成梯度洗脫的再平衡［17－21］。此外，水分子會在HILIC固定相表面形成水膜，而反反相固定相因表面的疏水性較強(qiáng)不會形成水膜。因此，反反相柱不需要用水進(jìn)行清洗。

鑒于反反相色譜柱的上述優(yōu)點(diǎn)，本文采用Diamond Hydride反反相色譜柱，對比了不同流動(dòng)相對色譜的分離和靈敏度。首先考察了不同pH值流動(dòng)相對色譜分離的影響，結(jié)果表明，不同pH值的流動(dòng)相對GLY及其代謝物的保留幾乎無影響;對比了氨水和乙酸銨水溶液對色譜分離的影響，結(jié)果表明，乙酸銨水溶液的色譜峰形更符合色譜分析的要求;對比了不同濃度乙酸銨水溶液對色譜分離的影響，發(fā)現(xiàn)隨著乙酸銨濃度的增加，GLY及其代謝物的保留增強(qiáng)，但超過5 mmol/L后呈下降趨勢。因此，本文采用如“1.2.3”所示的流動(dòng)相，其色譜分離結(jié)果如圖3所示。

圖3 50 μg/L GLY(A)和 50 μg/L AMPA(B)的MRM色譜圖Fig.3 Chromatograms of 50 μg/L GLY(A)and 50 μg/L AMPA(B)under MRM mode

2.3 樣品凈化條件的優(yōu)化

GLY化學(xué)名為N-(膦?；谆?甘氨酸，屬于弱有機(jī)酸，有3個(gè)羥基和1個(gè)羧基，存在四級電離，分別為:pKa1=0.78，pKa2=2.09，pKa3=5.96，pKa4=10.98;AMPA比GLY少1個(gè)羧基，也存在三級電離，因此，GLY和AMPA與溶劑之間既存在離子作用力，又存在氫鍵的范德華力。本文采用陰離子交換柱MAX小柱、親水親酯平衡的HLB小柱和具有強(qiáng)極性的氨基柱，并根據(jù)各種小柱的特點(diǎn)和使用條件，對樣品進(jìn)行凈化，其凈化結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，陰離子交換柱MAX的分離效果最好，空白加標(biāo)回收率在90%以上，HLB柱次之，氨基柱最差。因此本文使用MAX小柱凈化樣品。

圖4 不同凈化小柱在不同加標(biāo)濃度下的凈化結(jié)果Fig.4 The purification results of different columns spiked concentration(1 －3):20，50，100 μg/L

2.4 方法的線性范圍及靈敏度

用標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成系列濃度的工作液，GLY的質(zhì)量濃度為10～500 μg/L，AMPA的質(zhì)量濃度為20～1 000 μg/L，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣(5 μL)，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)，定量離子對的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表2)。由表2可見，各分析物的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，相關(guān)性良好。

采用向空白樣品中逐級降低加標(biāo)濃度的方法來確定檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。以3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為檢出限，以10倍信噪比(S/N=10)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為定量下限，結(jié)果如表2所示。

表2 GLY和AMPA的線性方程、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 2 Calibration curves，limits of detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)for GLY and AMPA

2.5 方法的準(zhǔn)確度、精密度及特異性

在優(yōu)化條件下，對紅茶、綠茶、花茶、青棗、白蘿卜、毛豆6種樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)以及特異性分析。從空白譜圖及加標(biāo)譜圖看，分析目標(biāo)物與基體雜質(zhì)分離很好，不受基體雜質(zhì)干擾，加標(biāo)色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖一致(見圖5)。每個(gè)濃度平行做6個(gè)重復(fù)，加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果見表3。6種基質(zhì)中GLY、AMPA的回收率為78%～113%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～11.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本方法的基質(zhì)干擾小，重現(xiàn)性和精密度均可滿足草甘膦及其代謝物的殘留分析要求。

圖5 空白紅茶樣品(A)及其加標(biāo)樣品(B)的色譜圖Fig.5 Chromatograms of black tea(A)and spiked blank sample(B)spiked concentration of GLY and AMPA were 0.02 mg/kg and 0.04 mg/kg，respectively

表3 不同基體中GLY和AMPA的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of GLY and AMPA spiked in the 6 matrixes(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的檢測

利用本文建立的分析方法，對100個(gè)茶葉樣品、50個(gè)水果樣品和20個(gè)蔬菜樣品進(jìn)行測定，有26個(gè)樣品檢出GLY，其中茶葉的檢出率最高，檢出濃度為0.04～3.0 mg/kg，水果和蔬菜的檢出率較低，檢出濃度為0.01～0.5 mg/kg。

3 結(jié)論

本文采用水提取，MAX小柱凈化，反反相液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，建立了快速檢測茶葉、水果、蔬菜等食品中GLY和AMPA的分析方法。利用建立的方法對170個(gè)樣品進(jìn)行分析，檢出率為21.1%。方法的靈敏度高，回收率良好，適用于食品中GLY和AMPA的測定。

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