高效毛細(xì)管電泳法同時分離檢測土壤中三嗪類與磺胺類抗球蟲藥物的研究

蘇紅曉，檀華蓉，沈虎琴，田春秋

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，安徽 合肥 230036)

球蟲病是一種對家禽腸道有損害、分布很廣的寄生蟲病，它不僅可以引起雞只死亡、發(fā)育停滯，還可導(dǎo)致產(chǎn)蛋減少、飼料報酬低，對養(yǎng)禽業(yè)危害很大。目前球蟲病的有效防治技術(shù)有藥物防治、生物免疫、日糧調(diào)控等，藥物防治是防治球蟲病的主要手段［1－3］。而最常用的抗球蟲藥物為三嗪類中的地克珠利(Diclazuril)和磺胺類中的磺胺(Sulfanilamide)、磺胺氯吡嗪(Sulfaclozine)、磺胺喹啉(Sulfaquinoxaline)，它們因高效、低毒、廣譜的驅(qū)蟲特點而在我國得到廣泛應(yīng)用［3－6］。

此類抗球蟲藥物進(jìn)入到生物體后大部分以原藥和代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)動物的糞便、尿液進(jìn)入土壤、表層水體等生態(tài)環(huán)境中，在環(huán)境中降解非常緩慢，殘留時間長，經(jīng)長期積累對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生毒害作用，影響其中的植物、動物和微生物的正常生命活動，甚至通過生物鏈的傳遞，在人體內(nèi)達(dá)到較高濃度，最終影響人體健康［7－9］。因此，此類抗生素作為一類重要的環(huán)境有機(jī)污染物應(yīng)引起各方面關(guān)注。

目前，雖然抗球蟲類藥物的檢測方法已有相關(guān)報道［10－13］，但在環(huán)境中同時分析這兩類抗球蟲藥物的方法尚未見報道。本文利用毛細(xì)管電泳的高效、快速、運(yùn)行成本低等特點，建立了一種毛細(xì)管電泳方法，能夠同時檢測土壤中的上述4種抗球蟲藥物(結(jié)構(gòu)式見圖1)，為開展抗球蟲藥環(huán)境行為研究及應(yīng)對措施的制定提供了一種準(zhǔn)確、簡便的分析方法。

圖1 4種抗球蟲藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of four anticoccidial drugs

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效毛細(xì)管電泳儀(P/ACETMMDQ，Beckman，USA)配有二極管陣列檢測器和色譜工作站;未涂層熔融石英毛細(xì)管(60 cm×75 μm，河北永年與銳灃色譜器件有限公司);Seven Multi pH計(S40，Metter Toledo，CH);Milli-Q超純水制備系統(tǒng)(Millipore，USA);R系列－旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);調(diào)速多用振蕩器(上海智域分析儀器制造有限公司);H-1650臺式高速離心機(jī)(上海穗康儀器有限公司)。

磺胺(SA，純度 ＞99.8%)、磺胺氯吡嗪(SCP，純度 ＞99.8%)、磺胺喹啉(SQX，純度 ＞99.8%)、地克珠利(DIC，純度 ＞99.8%)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;硼砂、硼酸、四氫呋喃(THF)、KH2PO4、NaOH(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙腈為色譜純，實驗用水為超純水。樣品采自合肥周邊4個養(yǎng)雞場。樣品經(jīng)自然風(fēng)干、研碎后以60目篩篩分，儲存于廣口瓶中備用。

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取SA、SQX、SCP、DIC標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg，DIC用四氫呋喃溶解定容至10 mL，其它3種藥物用30 mmol/L NaOH溶液溶解定容至10 mL，分別配制成1.00 g/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液;上機(jī)前混合4種標(biāo)準(zhǔn)貯備液并用60%乙腈－水稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，備用。

樣品溶液:準(zhǔn)確量取1.00 g土壤樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L NaOH/THF(3∶2，體積比)提取液，封口后在恒溫振蕩器中振蕩24 h。靜置沉淀后，將上清液在10 000 r/min速度下離心5 min，分離上清液。將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，最后用H2O/THF(3∶2)溶液定容至1 mL，過 0.22 μm 微孔濾膜，供 HPCE 分析用［14－16］。

緩沖溶液:稱取一定量的硼砂，用水溶解定容，分別配制成30、50、70 mmol/L的硼砂溶液;稱取一定量的硼酸，用水溶解定容，配制成200 mmol/L的硼酸溶液;根據(jù)實驗需要將硼砂、硼酸溶液按一定比例混合，調(diào)pH值分別為8.4、8.6、8.8、9.0、9.2，過0.22 μm濾膜，備用。

1.3 實驗方法

未涂層熔融石英毛細(xì)管柱(60 cm×75 μm);運(yùn)行緩沖液為50 mmol/L硼砂－200 mmol/L硼酸緩沖液(pH 9.0);檢測波長220、254 nm;分離電壓23 kV;分離溫度25℃;樣品采用壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力3 448 Pa，進(jìn)樣時間5 s。

毛細(xì)管柱使用前用1、0.1 mol/L NaOH溶液、水分別清洗20 min。為保證實驗結(jié)果的重復(fù)性，每次進(jìn)樣前用0.1 mol/L NaOH溶液平衡毛細(xì)管柱2 min，水沖洗3 min，分析緩沖液平衡3 min［17－18］。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取液的選擇 4種抗球蟲藥物中的磺胺、磺胺氯吡嗪、磺胺喹啉均屬于磺胺類藥物，據(jù)文獻(xiàn)報道［9］，土壤中磺胺類藥物多采用0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液作提取劑;而土壤中地克珠利的提取方法未見報道，因地克珠利幾乎不溶于氫氧化鈉水溶液，故將4種藥物混合溶于乙腈的堿溶液、四氫呋喃的堿溶液、N，N-二甲基甲酰胺的堿溶液中，結(jié)果顯示，4種藥物在四氫呋喃堿溶液和N，N-二甲基甲酰胺堿溶液中易溶，在乙腈堿溶液中較難溶。而N，N-二甲基甲酰胺沸點較高，不利于下一步的濃縮，因此本實驗選擇0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液和四氫呋喃的混合液作為提取溶劑。

2.1.2 提取液體積比的確定 兩種提取劑的比例直接影響4種抗球蟲藥物的提取效率。本實驗考察了0.1 mol/L NaOH與THF提取液的體積比分別為2∶3、1∶1、3∶2、3∶1時對4種藥物提取率的影響(見圖2)，結(jié)果表明，當(dāng)NaOH與THF的體積比為3∶2時，4種藥物的提取率均在80%以上。

2.1.3 提取劑用量的確定 提取劑用量會影響4種藥物的提取效果，用量太少提取不完全;用量太多則會提取更多的雜質(zhì)［17］。實驗考察了提取劑用量為5、10、15、20 mL時的提取效果。結(jié)果表明，當(dāng)提取劑用量為5 mL時，4種藥物的提取率低于80%;當(dāng)提取劑用量為10、15、20 mL時提取率均能達(dá)到80%以上且無明顯變化。因此，實驗選擇提取劑用量為10 mL。

圖2 提取液體積比對4種抗球蟲藥提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction ratios on recoveries of four anticoccidial drugs

2.2 電泳分離條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的確定 對4種抗球蟲藥物在190～300 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描(結(jié)果見圖3)，SA在200 nm和254 nm處均有最大吸收，SQX和SCP在254 nm處有最大吸收，DIC在220 nm處有最大吸收。綜合考慮，選擇254 nm作為3種磺胺類藥物的最佳檢測波長，用220 nm作為地克珠利的最佳檢測波長。

圖3 4種抗球蟲藥的紫外光譜圖Fig.3 UV spectra of four anticoccidial drugs 1.SA，2.DIC，3.SQX，4.SCP

2.2.2 電泳緩沖液種類的影響 緩沖溶液種類對毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離效果有明顯的影響。本實驗分別考察了硼砂－硼酸、硼砂－氫氧化鈉、磷酸二氫鉀－硼砂3種不同緩沖體系對分離效率的影響。結(jié)果表明，磷酸二氫鉀－硼砂緩沖體系的分離效果較差;硼砂－氫氧化鈉緩沖體系基線漂移、噪音較大且遷移時間較長;而硼砂－硼酸緩沖體系中的峰形較理想，靈敏度較高。因此，選擇硼砂－硼酸作為最佳運(yùn)行緩沖液。

2.2.3 緩沖液pH值的影響 考察了50 mmol/L硼砂－200 mmol/L硼酸緩沖液的pH值為8.4、8.6、8.8、9.0、9.2時對DIC、SQX、SCP分離度的影響。結(jié)果表明，緩沖液pH值為9.0和9.2時，相鄰兩藥物間的分離度均能達(dá)到1.2以上，但pH 9.2時，遷移時間過長。因此，實驗選用pH 9.0的硼砂－硼酸緩沖液體系。

2.2.4 電泳緩沖液離子濃度的選擇 考察了緩沖體系在pH 9.0，硼酸濃度為200 mmol/L，硼砂濃度為30、50、70 mmol/L時對4種藥物分離的影響，結(jié)果見圖4。由圖可以看出，隨著緩沖液離子濃度的增大，遷移時間相應(yīng)增長。且遷移時間均在7.0 min左右，相鄰兩藥物間的分離度只能達(dá)到1.2，不能完全達(dá)到基線分離。因此，選擇不同離子濃度的硼砂－硼酸緩沖液作為正交實驗因子。

由圖還可以看出，磺胺與其它藥物的分離度很大，影響分離效果的主要是其它3種藥物間的分離度，所以本文重點考察了其它因素對DIC、SQX、SCP 3種藥物間分離度的影響。

2.2.5 分離電壓的影響 在其他條件相同的情況下，考察了分離電壓分別為21、23、25、27、29 kV時對后3種藥物分離的影響(結(jié)果見圖5)。由圖可以看出，隨著分離電壓的增加，遷移時間縮短，但分離度下降，當(dāng)分離電壓為29 kV時分離度不足1.2，而分離電壓為21 kV時遷移時間太長。因此本實驗選擇23、25、27 kV作為正交實驗因子。

2.2.6 分離溫度的影響 溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效率，一般在20～30℃之間進(jìn)行溫度選擇［18－19］。綜合考慮各方面的因素，選擇20、25、30℃作為正交實驗因子。

圖4 離子濃度對4種藥物分離的影響Fig.4 Effect of ion concentrations on separation of four anticoccidial drugs

圖5 分離電壓對4種藥物分離的影響Fig.5 Effect of voltages on separation of four anticoccidial drugs

2.3 正交實驗

為了進(jìn)一步優(yōu)化最佳分離分析條件，根據(jù)前期探索性試驗，選取3個相對重要的因素:緩沖體系的離子濃度、分離電壓和溫度進(jìn)行正交試驗，每個因素選取3個水平，以L9(33)3因素3水平實驗確立最佳的毛細(xì)管電泳分離條件，結(jié)果見表1。

表1 4種抗球蟲藥的3因素3水平正交實驗設(shè)計表Table 1 The L9(33)orthogonal experimental design table of four anticoccidial drugs

通過對以上多指標(biāo)正交實驗結(jié)果進(jìn)行分析可知，僅依靠數(shù)學(xué)分析無法得到正確的結(jié)果，所以綜合考慮實際中的分離度和遷移時間［19－20］，選擇第4組實驗為最優(yōu)試驗方案。其中，第4組實驗中的4種抗球蟲藥物的最小分離度同時達(dá)到了1.5以上，且遷移時間較短。因此最佳的電泳分離條件為:緩沖液為50 mmol/L硼砂－200 mmol/L硼酸(pH 9.0);運(yùn)行電壓為23 kV;運(yùn)行溫度為25℃。在最佳的分離條件下對4種藥物進(jìn)行電泳分離，結(jié)果見圖6。

圖6 4種抗球蟲藥混合標(biāo)準(zhǔn)液的電泳圖譜Fig.6 Electropherograms of four anticoccidial drugs mixed standards 1.SA，2.DIC，3.SQX，4.SCP

2.4 線性關(guān)系與精密度

在最佳電泳條件下，對1.56～50 mg/L 4種藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分析，考察峰面積(Y)與藥物質(zhì)量濃度(X)的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，在該范圍內(nèi)，4種藥物的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性，其回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r2)見表2。計算得到峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs，n=6)小于6%;遷移時間的RSD(n=6)小于0.2%，方法顯示了良好的精密度。

表2 4種抗球蟲藥的線性方程、線性系數(shù)、加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Calibration curves，correlation coefficients，spiked recoveries and RSDs of four drugs

2.5 實際樣品的測定

在合肥周邊4個不同養(yǎng)雞場采集4份土壤樣品，按照“1.2”制備樣品溶液，在優(yōu)化電泳條件下進(jìn)行測定，每個樣品做2個平行。其中1、4號樣品檢出地克珠利，含量分別為1.02、1.24 mg/kg;3號樣品檢出磺胺氯吡嗪，含量為1.65 mg/kg;而2號樣品中4種藥物均未檢出(見圖7A)。結(jié)果顯示，目標(biāo)組分得到了很好的分離，且基質(zhì)干擾較小。

2.6 回收率實驗

分別向2號土壤樣品中加入2.0、5.0、10.0 mg/kg 3種水平的4種抗球蟲藥標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按照“1.2”制備樣品溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，在優(yōu)化電泳條件下，得到加標(biāo)土壤樣品的電泳圖(圖7B)。每個水平平行測定3次，4種抗球蟲藥的回收率在77%～90%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為6.3%～8.1%(見表2)。

圖7 2號土壤樣品(A)及加標(biāo)土壤樣品(B)的電泳圖Fig.7 Electropherograms of the second soil sample(A)and spiked the second soil sample(B)1.SA，2.DIC，3.SQX，4.SCP

3 結(jié)論

本文建立了同時提取土壤中兩類抗球蟲藥物的前處理方法，該方法提取率高，可有效去除樣品中的雜質(zhì)，色譜圖背景簡單，無干擾峰，結(jié)果令人滿意。所確立的毛細(xì)管電泳法與其他分析方法相比，簡便易行、成本低，為同時快速檢測土壤中兩類常用抗球蟲藥物提供了一種更有效的分析手段。

［1］Hafez M H.Archiv.Fur.Geflugelkunde，1995，72(1):2－7.

［2］Yang X F，Zhong H，Zhao D H.J.Anhui Agric.Sci.(楊雪峰，鐘華，趙東豪.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2006，34(20):5257－5258.

［3］Wang X H，Liang J P，Liu Y，Guo W Z，Guo Z T.China Poultry(王學(xué)紅，梁劍平，劉宇，郭文柱，郭志廷.中國家禽)，2010，32(15):48－51.

［4］Hong X.Modern Animal Husbandry(洪學(xué).當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè))，2011，3:18－21.

［5］Guo C J，Xu G L.J.Veter.Med.(郭春江，徐國梁.獸藥)，2010，10:180.

［6］Liu Y M，Peng G L.Chinese Journal of Rabbit Farming(劉以民，彭光林.中國養(yǎng)兔)，2008，11:25－27.

［7］Jin C X，Gao R S，Wu C Y.J.Zhejiang Agric.Sci.(金彩霞，高若松，吳春艷.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué))，2011，(1):127－131.

［8］Diao X P，Sun Z J，Shen J Z.Chin.J.Appl.Ecol.(刁曉平，孫振鈞，沈建忠.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報)，2004，15(2):321－325.

［9］Zhang C L.The Environmental Behavior and the Related Thermodynamic Study of Sulfaclozine Drugs.Zhengzhou:Zhengzhou University(張從良.磺胺類藥物環(huán)境行為及相關(guān)熱力學(xué)基礎(chǔ)研究.鄭州:鄭州大學(xué))，2007.

［10］Dong J，Gong X M，Zhang L，Sun J，Wang H T.Chin.J.Health Lab.Technol.(董靜，宮小明，張立，孫軍，王洪濤.中國衛(wèi)生檢驗雜志)，2008，18(1):26－28.

［11］Gong X M，Sun J，Dong J，Yu J L，Wang H T.Chin.J.Chromatogr.(宮小明，孫軍，董靜，于金玲，王洪濤.色譜)，2011，3:217－222.

［12］Mortier L，Daeseleire E，Huyghebaert G，Delahaut P.J.Agric.Food Chem.，2005，53(4):905－911.

［13］Shi Z H，Lu J X，Ge Q L，Gong J S，Liu X X，Qi K Z.Chin.J.Veter.Med.(施祖灝，陸俊賢，葛慶聯(lián)，龔建森，劉學(xué)賢，祁克宗.中國獸藥雜志)，2008，42(9):13－16.

［14］Zhang C L，Wen C B，Wang Y，Wang F A.J.Anal.Sci.(張從良，文春波，王巖，王富安.分析科學(xué)學(xué)報)，2007，23(5):616－618.

［15］Elena M C，Carmen B，Sigrid S，Oliver G.Environ.Pollut.，2007，148:570 －579.

［16］Holger H，Kornelia S.Environ.Microbiol.，2007，9(3):657 －666.

［17］Shen H Q，Tan H R，Qi K Z，Tian C Q.J.Instrum.Anal.(沈虎琴，檀華蓉，祁克宗，田春秋.分析測試學(xué)報)，2012，31(3):302－306.

［18］Chen Y.Technology and Application of Capillary Electrophoresis.Beijing:Chemical Industry Press(陳義.毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用.北京:化學(xué)工業(yè)出版社)，2000:40.

［19］Tian C Q，Tan H R，Gao L P，Shen H Q，Qi K Z.Chin.J.Chromatogr.(田春秋，檀華蓉，高麗萍，沈虎琴，祁克宗.色譜)，2011，29(11):1128－1132.

［20］Li Y Y，Hu C R.Experiment Design and Date Processing.Beijing:Chemical Industry Press(李云雁，胡傳榮.實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理.北京:化學(xué)工業(yè)出版社)，2005:89.