抗VEGF單克隆抗體Fab片段在大腸桿菌的表達(dá)①

霍世元 朱文華 滕 凌 葉亞東

(常州亞當(dāng)生物技術(shù)有限公司，常州213022)

1971年，美國科學(xué)家?？寺?Judah Folkman)在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》中提出，抗血管生成可能是一種有效的抗癌手段［1］。從七十年代早期開始，以這個(gè)前瞻性的假說為基礎(chǔ)，?？寺捌溲芯啃〗M致力于從人體和動(dòng)物的腫瘤中分離某種“腫瘤血管生成因子”［2］。1978年，Gullino也提出了抑制血管生成能避免癌癥的觀點(diǎn)［3］。隨后，多種血管源因子如表皮生長因子 EGF，轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-α、TGF-β，腫瘤生長因子TNF-α和血管生長素等先后被發(fā)現(xiàn)［4］。

由于與傳統(tǒng)的抗癌治療相比，抗血管生成治療具有許多優(yōu)點(diǎn)。因此在過去的三十多年中，人們一直在努力尋找合適的靶點(diǎn)以阻斷和破壞腫瘤血管生成，研制有效的抗腫瘤血管生成藥物，近年來取得了許多令人鼓舞的成績。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)正是這樣一個(gè)血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［5］，現(xiàn)已成為抗血管生成抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。2004年，第一個(gè)靶向VEGF抗腫瘤血管生成的抗體藥物——安維汀(Bevacizumab，Avastin)獲得 FDA批準(zhǔn)上市，2012年銷售額已突破60億美元，成為安進(jìn)的明星級(jí)重磅炸彈藥物。我國已有以VEGF為靶點(diǎn)的新型抗體的研究報(bào)道，但無相關(guān)生產(chǎn)工藝專利。而進(jìn)口藥物價(jià)格高，尚未滿足國內(nèi)臨床需求。

經(jīng)過多年的艱苦研發(fā)，我們自主研制出一個(gè)抗VEGF的治療性單抗藥物，命名為眼明(Vasculizumab)，已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利授權(quán)(抗VEGF單克隆抗體 Fab片段 Vasculizumab及其應(yīng)用，ZL201110225852.7)。前期研究結(jié)果表明其對(duì)VEGF有良好的靶向作用，主要用于治療視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑病變等眼底疾病。眼明是一個(gè)Fab片段，分子量相對(duì)大分子全抗體較小，通透性強(qiáng)，并且利用原核系統(tǒng)大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，可降低大規(guī)模生產(chǎn)的成本。本研究通過基因合成該Fab片段，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建共表達(dá)載體pET21a-LC-HC，初步表達(dá)出帶活性的眼明Fab，為該藥物將來的規(guī)模化生產(chǎn)奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 質(zhì)粒pET21a，大腸桿菌菌株E.coli BL21(DE3)購自英杰生命技術(shù)公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)由中國藥科大學(xué)提供。

1.1.2 酶及試劑 酵母提取物、胰蛋白胨購自O(shè)xoid公司;限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ購自TaKaRa公司;T4 DNA連接酶、DNA Marker等PCR相關(guān)試劑、蛋白質(zhì)Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)等購自大連寶生物技術(shù)公司;PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自Biomiga公司;Protein G，Protein L購自Pharmacia公司;其他常用化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 引物序列 M13 F:5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3';M13R:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'。Hc-forward2:5'-CAGGGATCCAATTAATACGACTCACTATAGGG-3';HcX-rev-1:5'-GATCTCGAGTTATTTCTTGTCAA-3'。

1.2 方法 質(zhì)粒DNA提取、電泳、酶切、菌感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化等操作參見文獻(xiàn)［6］。瓊脂糖凝膠中DNA片段的回收參見試劑盒說明。

1.2.1 基因合成 按照我們擁有的眼明氨基酸序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成工作，測序正確。

1.2.2 輕鏈質(zhì)粒構(gòu)建

數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比(%)表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.2.1 目的基因片段的獲得 PCR反應(yīng)體系:2 ×Pfu Master mix 40 μl，10 μmol/L 上下游引物各1 μl，模板質(zhì)粒 1 μl，加 ddH2O 至總體積為 80 μl。

熱循環(huán)參數(shù):94℃ 5分鐘;94℃ 20秒，55℃ 20秒，72℃1分鐘，25個(gè)循環(huán);72℃ 5分鐘;PCR產(chǎn)物切膠試劑盒回收。

1.2.2.2 目的基因/載體雙酶切 目的基因酶切體系:10 × K Buffer 7 μl，Nde Ⅰ 1 μl、BamH Ⅰ 1 μl、基因片段20 μl，加ddH2O 至70 μl。37℃過夜，雙酶切產(chǎn)物乙醇沉淀法回收。

pET21a載體酶切體系:10 × K Buffer 7 μl，NdeⅠ 1 μl，BamH Ⅰ 1 μl，質(zhì)粒 1 μg，加 ddH2O 至 70 μl。37℃過夜，切膠純化試劑盒回收。

1.2.2.3 目的基因與載體連接 連接體系:10×T4連接酶 Buffer 1.5 μl，載體 5 μl，片段 7.5 μl，T4 連接酶1 ml，16℃連接過夜。

1.2.2.4 轉(zhuǎn)化 DH5α 大腸桿菌 連接液轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取克隆進(jìn)行PCR鑒定，PCR體系:2 × super Taq Master mix 70 μl，10 μmol/L 上下游引物各 1 μl，模板菌液 2 μl，加 ddH2O 至總體積為 140 μl。

熱循環(huán)參數(shù):94℃ 5分鐘;94℃ 20秒，55℃ 20秒，72℃ 20秒，25個(gè)循環(huán);72℃ 5分鐘。挑選PCR結(jié)果為陽性進(jìn)行測序比對(duì)。

1.2.4 蛋白表達(dá)及純化

1.2.4.1 轉(zhuǎn)化 取出在 －80℃凍存的 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，立即放置于冰上，待解凍后轉(zhuǎn)化。取1 μl質(zhì)粒加到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，在冰上孵育30分鐘，42℃熱激90秒，立即置冰上3分鐘。加入37℃預(yù)熱的500 μl LB液體無抗培養(yǎng)基，37℃、200 r/min搖晃培養(yǎng)50分鐘。然后取100～200 μl上述菌液涂布在含有 Amp(50 μg/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)及表達(dá)小試 在 E.coli BL21(DE3)轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落并接種于2 ml LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/ml Amp)中，37℃ 200 r/min震搖培養(yǎng)3小時(shí)至對(duì)數(shù)生長期，取200 μl培養(yǎng)菌液作對(duì)照(未誘導(dǎo))，剩余的培養(yǎng)基加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L 后，18℃、200 r/min 震搖培養(yǎng)，18 小時(shí)后收集培養(yǎng)菌液于離心管中。各取200 μl菌液于離心管中，離心去上清，分別取40 μl H2O重懸(誘后全菌)，誘導(dǎo)前全菌樣同樣處理。其余菌液離心，菌體用600 μl 1 ×PBS(pH7.4)重懸，超聲破碎菌體，取40 μl高速離心 (兩份)，分離上清(誘導(dǎo)后破菌上清)，加入10 μl 5× loading Buffer(還原，非還原)，混勻，煮沸5分鐘，2 000 r/min離心5分鐘，取10 μl上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.4.3 Protein G/L 親和層析純化 用 10 ml起始緩沖液(pH7.0，20 mmol/L磷酸緩沖液)平衡Protein G-瓊脂糖親和層析柱(Hi Trap Protein G 1 ml)。取待純化的樣品(每毫升樣品含蛋白10～20 mg)15 ～25 ml上柱，流速為 0.5 ml/min，然后以同樣的流速依次用起始緩沖液8 ml、洗脫緩沖液(pH2.7，0.1 mmol/L 甘氨酸鹽酸)6 ml、起始緩沖液5 ml洗滌，每管1 ml收集洗脫液，測每管OD280吸收值。收集第2洗脫峰，BCA法測蛋白含量，4℃保存?zhèn)溆?。Protein L純化過程參照Protein G親和層析操作。

1.2.5 ELISA 檢測 用 PBS(pH7.4)稀釋 VEGF165至濃度 1.0 μg/ml，100 μl/孔，4℃ 包被過夜。棄去包被液后用 PBS洗板3次，加入200 μl封閉液1(PBS+3%BSA)，室溫封閉1.5小時(shí)。PBS洗板3次，用封閉液2(PBST+3%BSA)按不同比例分別稀釋相關(guān)樣品，100 μl/孔，室溫孵育2小時(shí)。用 PBST洗板3次，加入100 μl HRP偶聯(lián)的二抗(抗人的IgG，用封閉液2按1∶2 000比例稀釋)，室溫孵育2小時(shí)。PBST洗板3次，再用PBS洗1次。加入100 μl底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，室溫避光顯色20分鐘。取出每孔加入100 μl終止液停止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定A450nm計(jì)算結(jié)合率。

2 結(jié)果

2.1 輕鏈質(zhì)粒構(gòu)建 對(duì)眼明(Vasculizumab)輕鏈氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化后進(jìn)行基因合成，然后以基因合成輕鏈質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物為M13F/M13R)，以獲得目的基因(圖1A)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。回收產(chǎn)物與pET21a載體分別進(jìn)行NdeⅠ/BamHⅠ雙酶切，最后將雙酶切產(chǎn)物連接到pET21a載體上。重組載體轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取9個(gè)克隆進(jìn)行鑒定。選PCR結(jié)果為陽性的1、2、9號(hào)克隆進(jìn)行測序比對(duì)(圖1B)，2和9測序正確，說明輕鏈基因已經(jīng)成功克隆至載體pET21a上。

圖1 輕鏈質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Construction of pET21a-LC

2.2 共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 以基因合成重鏈質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2A)，NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切處理重鏈基因片段與pET21a質(zhì)粒，連接轉(zhuǎn)化到DH5α中篩選陽性轉(zhuǎn)化子。用引物Hc-forward2/HCX-rev-1擴(kuò)增得到目的基因(5'端含T7 promoter及RBS序列)，BamHⅠ/XhoⅠ處理片段及輕鏈質(zhì)粒，連接液轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取10個(gè)克隆進(jìn)行鑒定和測序比對(duì)(圖2C)，偏碼4測序正確，說明共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2B)，可以進(jìn)行表達(dá)宿主菌的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 誘導(dǎo)表達(dá) 將測序正確的共表達(dá)質(zhì)粒pET21a-LC-HC用熱激法轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達(dá)菌株中，取100 ～200 μl菌液涂布在含有 Amp(50 μg/ml)的LB平板上，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑單個(gè)菌落接種于2 ml LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/ml Amp)中，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.5～0.6 后，加入 IPTG(0.1 mmol/L)于18℃誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)，收集培養(yǎng)菌液于離心管中，分開上清與沉淀SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)結(jié)果。電泳結(jié)果顯示，目的蛋白有表達(dá)，大小約為28 kD，說明Fab蛋白在E.coli BL21(DE3)中主要以包涵體形式存在，上清中表達(dá)量相對(duì)較低(圖3)。

周質(zhì)表達(dá)雖然有較多的蛋白形成包涵體，但在上清中25 kD左右，和沉淀相同位置可以看到目的蛋白有一定量的可溶表達(dá)(圖4)。之后用ELISA檢測周質(zhì)表達(dá)上清是否有Fab活性，如果能確定有Fab活性，也說明共表達(dá)成功。

2.4 ELISA鑒定 篩選出有表達(dá)的克隆，取其菌液100 μl接于100 ml LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接至1 L LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，待其 OD600值至0.6左右加入0.1 mmol/L IPTG 18℃誘導(dǎo)表達(dá)18小時(shí)，離心收菌體。破菌收集周質(zhì)表達(dá)上清做ELISA活性鑒定(表1)，結(jié)果證明培養(yǎng)上清中的Fab片段可與抗原VEGF165特異結(jié)合，結(jié)合活性良好。

圖2 共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建Fig.2 Construction of pET21a-LC-HC

圖3 SDS-PAGE鑒定Fig.3 Using SDS-PAGE to identify

圖4 10%SDS-PAGEFig.4 10%SDS-PAGE

2.5 初步純化 周質(zhì)表達(dá)上清經(jīng)Protein G純化后做ELISA檢測(結(jié)果未給出)表明，上柱前樣品和上柱后流穿中Fab活性相當(dāng)，而上柱后洗脫樣品基本無Fab活性，說明Protein G對(duì)目的蛋白無富集純化效果。然后我們選擇 Protein L進(jìn)行純化，SDSPAGE電泳結(jié)果如圖5。

表1 Fab片段與VEGF165結(jié)合反應(yīng)的ELISA測定Tab.1 The ELISA determination of binding reaction between Fab fragment with VEGF165

圖5 Protein L純化結(jié)果Fig.5 Result of purification by protein L

由于輕鏈和重鏈都含有分子內(nèi)二硫鍵，在還原狀態(tài)下二硫鍵全部打開，電泳時(shí)條帶很清晰。而在非還原電泳條件下二硫鍵未打開，在分子量偏小的地方能隱約看到條帶，原因可能主要是蛋白量太少。

3 討論

本研究利用基因合成得到了眼明Fab蛋白的全長基因，構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過對(duì)目的蛋白表達(dá)條件的摸索，使Fab蛋白獲得了高效的表達(dá)。

在大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段是抗體工程的重要進(jìn)展［7］，本研究采用大腸桿菌周質(zhì)分泌表達(dá)Fab蛋白，由于外源蛋白在細(xì)胞質(zhì)中過度積累會(huì)影響細(xì)胞正常的生理功能，而外源蛋白以分泌蛋白的形式表達(dá)則可以解決這一問題。分泌型蛋白是指將外源基因的表達(dá)產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)或細(xì)胞外的一種表達(dá)方式。本研究在抗體基因上游補(bǔ)充了OmpA信號(hào)肽序列，使抗體片段表達(dá)于周質(zhì)，并在這一類似于真核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的氧化環(huán)境中完成折疊及二硫鍵的形成［8］。周質(zhì)的氧化環(huán)境有利于蛋白的正確折疊，獲得具有較好的生物學(xué)活性的蛋白，而且周質(zhì)中的蛋白酶較少，外源蛋白質(zhì)酶解的程度較低。然而眼明Fab主要形成了包涵體，上清中表達(dá)量相對(duì)較低。盡管周質(zhì)表達(dá)上清經(jīng)ELISA檢測有Fab活性，仍需要通過優(yōu)化表達(dá)條件提高周質(zhì)目的蛋白的可溶表達(dá)量，然后再探索純化方法。另外也可重新構(gòu)建Fab周質(zhì)共表達(dá)載體，采用PhoA啟動(dòng)子，StlI大腸桿菌周質(zhì)表達(dá)信號(hào)肽，比較周質(zhì)可溶表達(dá)量是否有差異。

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