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    間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)EAE小鼠Treg細(xì)胞功能的影響

    2013-11-27 11:15:44劉萍萍李倩如朱敬松軒小燕管莎莎
    中國免疫學(xué)雜志 2013年10期
    關(guān)鍵詞:胸腺脾臟神經(jīng)功能

    劉萍萍 李倩如 朱敬松 軒小燕 管莎莎 杜 英

    (鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室,鄭州450001)

    實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelintis,EAE)是一種主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的,以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病[1]。有研究表明 EAE小鼠CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)細(xì)胞數(shù)量和免疫抑制功能均降低,給EAE小鼠輸入功能性Treg能改善其病理狀況[2,3]。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)是骨髓中除造血干細(xì)胞外的另一種成體干細(xì)胞,具有強(qiáng)大的自我更新和多向分化能力,能分化成多種組織細(xì)胞,如神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等,并且MSCs具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性,能抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖,能誘導(dǎo)產(chǎn)生 Treg[4-7]。本研究旨在通過觀察MSCs移植EAE小鼠前后體內(nèi)免疫器官中Treg數(shù)量及功能的變化,探討 MSCs移植在治療EAE小鼠中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠70只,6~8周齡,體重(20±2)g,購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。MOG多肽由聯(lián)美生物科技有限公司合成,結(jié)核菌素購自美國DIFCO公司,百日咳毒素購自中國藥品生物制品檢定所,不完全弗氏佐劑(IFA)購自Sigma公司,抗小鼠熒光標(biāo)記單抗:PE-Foxp3、FITC-CD4、APC-CD25 及同型對(duì)照,antimouse CD28、anti-mouse CD3均購自美國 eBioscience公司,SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒購自TaKara公司,CD4+CD25+細(xì)胞免疫磁珠分選試劑盒購自德國Miltenyi Biotec公司。

    1.2 EAE模型的建立 60只C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分為EAE模型組、EAE模型MSCs移植組、正常對(duì)照組,每組20只。EAE模型組及EAE模型MSCs移植組自小鼠腋下至尾部皮下多點(diǎn)注射免疫乳劑100 μl,免疫乳劑含 MOG 50 μg、結(jié)核菌素 500 μg、不完全弗氏佐劑50 μl。分別于致敏第2天、第4天,小鼠腹部皮下注射百日咳毒素200 ng。致敏第7天再次注射免疫乳劑。致敏后小鼠常規(guī)飼養(yǎng)。

    1.3 小鼠神經(jīng)功能評(píng)分 EAE誘導(dǎo)后,每日觀察小鼠癥狀、體征和體重變化,參照Kono等的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分為無癥狀,1分為出現(xiàn)尾巴無力,2分為尾部和后肢無力,3分為后肢癱瘓,4分為后肢癱瘓加前肢無力,5分為瀕死狀態(tài)或死亡。免疫原致敏14~20天,凡評(píng)分≥1分者可作為EAE模型。

    1.4 骨髓MSCs的分離和培養(yǎng) 無菌分離正常C57BL/6J小鼠股骨和脛骨,暴露骨髓腔,用生理鹽水沖洗骨髓腔,將收集的細(xì)胞液經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾,1 000 r/min離心15分鐘收集細(xì)胞,紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,用含10%胎牛血清和20 ng/ml bFGF的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,細(xì)胞濃度調(diào)至5×105ml-1,置37℃、5%CO2培養(yǎng)。24小時(shí)后去除未貼壁的細(xì)胞,將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞生長情況,待細(xì)胞融合至貼滿瓶壁的80%以上,用胰蛋白酶-EDTA液進(jìn)行消化,傳代。利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長狀況。

    1.5 MSCs的移植 將培養(yǎng)的MSCs經(jīng)胰酶消化,PBS離心洗滌3次,加入PBS重懸細(xì)胞后,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1,經(jīng)小鼠尾靜脈注射EAE模型MSCs移植組(每只0.2 ml),共2次,間隔2天。正常對(duì)照組及EAE模型組小鼠尾靜脈注射0.2 ml PBS。

    1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析Treg的數(shù)量 在MSCs移植后第20、40、60天,隨機(jī)處死各組小鼠5只,分別無菌獲取胸腺、脾臟、淋巴結(jié),通過機(jī)械研磨、裂解紅細(xì)胞后,PBS洗3次,制成單個(gè)核細(xì)胞懸液。加入FITC-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3 抗小鼠 mAb及同型對(duì)照抗體三標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD公司)檢測(cè)。

    1.7 Real time RT-PCR法檢測(cè)Foxp3和相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá) MSCs移植后分別于第20、40、60天獲取小鼠脾臟和淋巴結(jié),加入Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總RNA,用RT Kit(Takara公司)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用 SYBR green I real time PCR Kit(TaKaRa公司)試劑盒擴(kuò)增目的基因,引物由上海生工合成,F(xiàn)oxP3:sence 5'agg aga aag cgg ata cca 3',anti-sence 5'tgt gag gac tac cga gcc 3';IL-10 sence 5'ttt caa aca aag gac cag 3',anti-sence 5'gga tca ttt ccg ata agg 3';TGF-β1:sence 5'cta atg gtg gac cgc aac aac g 3',anti-sence 5'gca ctg ctt ccc gaa tgt ctg 3';IL-4:sence 5'tcc tgc tct tct ttc tcg 3',anti-sence 5'ttc tcc tgt gac ctc gtt3';GAPDH(內(nèi)參照):sence 5'gtt gtc tcc tgc gac ttc a 3',anti-sence 5'ggt ggt cca ggg ttt ctt a 3'。

    1.8 檢測(cè)Treg對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞(Teff)增殖的抑制作用 免疫磁珠法分選各組小鼠脾臟CD4+CD25+及CD4+CD25-細(xì)胞,分選方法參照免疫磁珠分選試劑盒說明書。用CD3單抗包被96孔培養(yǎng)板,先將正常對(duì)照組小鼠的CD4+CD25-細(xì)胞重懸到含10%胎牛血清、100 U/ml IL-2、1 μg/ml CD28 mAb的RPMI1640培養(yǎng)液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1,取100 μl加入到各包被孔中,然后分別加入正常對(duì)照組、EAE組、EAE模型 MSCs移植組的CD4+CD25+細(xì)胞各100 μl(細(xì)胞濃度1 ×106ml-1),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置5%CO2飽和濕度37℃培養(yǎng)24小時(shí)。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。

    2 結(jié)果

    2.1 MSCs體外培養(yǎng)、增殖特征 初分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈現(xiàn)為小球形,誘導(dǎo)培養(yǎng)3~4天后部分細(xì)胞貼附于培養(yǎng)瓶壁,形狀似紡錘形,有較強(qiáng)折光性。培養(yǎng)至7~10天,絕大多數(shù)細(xì)胞貼附于瓶壁,并逐漸生長形成分散的或條索狀聚集狀態(tài),細(xì)胞體積顯著增大。繼續(xù)傳代培養(yǎng),通過MTT法檢測(cè)MSCs增殖活性,顯示第4、5代細(xì)胞增殖能力最強(qiáng),隨傳代次數(shù)增加,MSCs增殖能力逐漸減弱,并出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)顆粒、細(xì)胞碎片等老化現(xiàn)象,因此利用傳4~5代的MSCs進(jìn)行細(xì)胞移植,見圖1。

    2.2 MSCs移植對(duì)EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響MSCs移植前,EAE模型組、EAE模型MSCs移植組小鼠于EAE誘導(dǎo)14天均出現(xiàn)顯著異常表現(xiàn),85%EAE誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能評(píng)分增加,達(dá)到2分以上,部分小鼠出現(xiàn)尾部癱瘓、弓背,部分小鼠表現(xiàn)為后肢無力、甚至癱瘓。MSCs移植后,EAE模型MSCs移植組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低,神經(jīng)功能持續(xù)改善,與EAE對(duì)照組相比有顯著差異,P<0.05,見表1。

    2.3 各組小鼠脾臟、淋巴結(jié)、胸腺 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,MSCs移植后第20天,EAE模型MSCs移植組和正常對(duì)照組胸腺、脾臟和淋巴結(jié)中的 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例均顯著高于EAE模型組(P<0.05),見圖2。

    2.4 各組小鼠淋巴器官 Foxp3、TGF-β1、IL-10 mRNA的水平 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Foxp3在正常對(duì)照組胸腺、脾臟和淋巴結(jié)穩(wěn)定表達(dá),EAE模型組小鼠各淋巴器官Foxp3 mRNA水平逐漸降低,與正常對(duì)照組相比有顯著差異,P<0.05。EAE模型MSCs移植組在MSCs移植前胸腺、脾臟和淋巴結(jié)Foxp3 mRNA呈現(xiàn)低表達(dá),MSCs移植20天后,逐漸升高,IL-10、TGF-β1 mRNA 水平亦逐漸升高,移植后第50天,上述細(xì)胞因子mRNA水平均與EAE模型組相比有顯著差異,P<0.05(見表2,圖3)。

    圖1 體外培養(yǎng)傳代MSCs形態(tài)(×200)Fig.1 Themorphology of MSCs subcultured in vitro(×200)

    表1 MSCs移植對(duì)EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響(n=20)Tab.1 The influence of MSCs transplantation on clinical score of EAE mice(n=20)

    圖2 MSCs移植對(duì)小鼠脾臟、淋巴結(jié)、胸腺CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量的影響Fig.2 The effection of MSCs transplantation on the frequency of CD4+CD25+Foxp3+T in spleen,lymph node and thymus of mice

    圖3 MSCs移植對(duì)各組小鼠淋巴器官Foxp3、TGF-β、IL-10 mRNA水平的影響Fig.3 The influence of MSCs transplantation on the mRNA level of Foxp3,TGF-β and IL-10 in lymph organs of mice

    表2 MSCs移植后50天各組細(xì)胞因子mRNA水平(±s)Tab.2 The level of cytokines mRNA on 50d after MSCs transplantation(±s)

    表2 MSCs移植后50天各組細(xì)胞因子mRNA水平(±s)Tab.2 The level of cytokines mRNA on 50d after MSCs transplantation(±s)

    Note:Compared with EAE mice,1)P <0.05.

    Group.35 6.52±0.42 EAE mice with MSCs 5.24±0.181)14.88±0.281)14.26±0.351)6.42±0.271)9.12±0.351)14.45±0.411)8.02±0.351)12.54±0.401)10.84±0.371)1 IL-10 EAE mice 3.01±0.21 11.56±0.26 11.23±0.32 4.35±0.21 4.67±0.34 8.46±0.41 5.23±0.38 8.74±0 Thymus Spleen Lymph node Foxp3 TGF-β1 IL-10 Foxp3 TGF-β1 IL-10 Foxp3 TGF-β 3 13.12±0.39 10.05±0.29 Normal control 6.14±0.16 15.26±0.19 15.46±0.33 6.74±0.17 8.71±0.32 10.23±0.52 8.06±0.3

    圖4 CD4+CD25+Treg對(duì)CD4+CD25-Teff增殖的抑制作用Fig.4 The suppression of CD4+CD25+Treg on the proliferation of CD4+CD25-Teff

    2.5 Treg對(duì)Teff增殖的抑制作用 與正常對(duì)照組相比,EAE組小鼠Treg對(duì)Teff增殖的抑制作用顯著降低,P<0.05,MSCs移植組Treg對(duì)Teff增殖作用顯著增強(qiáng),與EAE組相比有顯著差異,P<0.05,見圖4。

    3 討論

    EAE的臨床表現(xiàn)、病理特征及免疫異常等均與MS相似,故被作為研究MS發(fā)病機(jī)制和治療策略的動(dòng)物模型。MS和EAE中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病變與效應(yīng)性T細(xì)胞過度活化、炎癥細(xì)胞在CNS浸潤、前炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)的產(chǎn)生高度相關(guān)[8]。

    Treg是體內(nèi)一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群,其數(shù)量減少或功能缺失可導(dǎo)致多種自身免疫病的發(fā)生[9]。Foxp3被認(rèn)為是Treg的重要標(biāo)志,是Treg發(fā)育和發(fā)揮功能的關(guān)鍵因素,可能影響Treg的發(fā)育及其免疫調(diào)節(jié)過程[10]。Treg與效應(yīng)細(xì)胞之間的相互接觸也可通過Treg分泌的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β實(shí)現(xiàn)。有研究表明去除Treg的小鼠易發(fā)生EAE,過繼轉(zhuǎn)移Treg細(xì)胞則有助于預(yù)防EAE的發(fā)生[11]。本研究結(jié)果顯示,MOG誘導(dǎo)的EAE小鼠模型,伴有胸腺、脾臟、淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例減少、Foxp3表達(dá)降低,說明Foxp3 mRNA表達(dá)水平降低直接影響CD4+CD25+Foxp3+Treg在胸腺和脾臟、淋巴結(jié)的數(shù)量,且與免疫功能紊亂相關(guān),與EAE的發(fā)生有關(guān)。

    已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)EAE小鼠通過輸入MSCs其臨床癥狀明顯減輕,中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥病灶及脫髓鞘程度均降低[12,13],移植的 MSCs可以在 EAE 小鼠淋巴結(jié)被發(fā)現(xiàn),認(rèn)為MSCs是通過抑制CD4+Th1細(xì)胞而起作用。本研究發(fā)現(xiàn)同基因MSCs移植能使MOG免疫的EAE小鼠癥狀好轉(zhuǎn)、神經(jīng)功能評(píng)分降低,提示MSCs移植能顯著改善EAE臨床進(jìn)程,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。在臨床評(píng)分降低的同時(shí),MSCs移植還能使EAE小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例增加,脾臟、淋巴結(jié)、胸腺Foxp3 mRNA表達(dá)上調(diào)。提示MSCs移植治療EAE的機(jī)制可能通過誘導(dǎo)Foxp3 mRNA表達(dá)增加和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)。

    已有數(shù)據(jù)表明,MSCs能通過產(chǎn)生TGF-β和IL-10發(fā)揮免疫抑制活性,F(xiàn)oxp3與Treg介導(dǎo)的免疫抑制調(diào)節(jié)作用通過誘導(dǎo) TGF-β和 IL-10的產(chǎn)生有關(guān)[14,15]。本研究結(jié)果顯示,EAE 組 Foxp3 mRNA 的表達(dá)在上述各器官的表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組,當(dāng)EAE組分別給予同基因MSCs移植后,F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)比EAE組顯著增加。提示MSCs移植能誘導(dǎo)Foxp3 mRNA的表達(dá)。同時(shí),TGF-β1 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)在MSCs移植組也比EAE組顯著增加,說明MSCs移植也能改變TGF-β1、IL-10的表達(dá)。MSCs移植后,F(xiàn)oxp3、TGF-β1和 IL-10 mRNA在胸腺、脾臟、淋巴結(jié)表達(dá)的增加,并且Treg對(duì)Teff增殖的抑制活性得以恢復(fù),MSCs可能通過這些機(jī)制發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性,改變EAE臨床進(jìn)程。

    1 Whitha R,Bourdette D,Hashim G et al.Lymphocytes from SJL/J mice immunized with spinal cord respond selectively to a peptide of proteolipid protein and transfer relapsing demyelinating experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,1991;146(1):101-107.

    2 Kohm A P,Carpentier P A,Anger H A et al.Cutting edge:CD4+CD25+regulatory T cells suppress antigen-specific autoreactive immune responses and central nervous system inflammation during active experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2002;169:4712-4716.

    3 Zhang X,Koldzic D N,Izikson L et al.IL-10 is involved in the suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by CD25+CD4+regulatory T cells[J].Int Immunol,2004;16:249-256.

    4 Pittenger M F,Mackay A M,Beck S C et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999;284:143-147.

    5 Reyes M,Dudek A,Jahagirdar B et al.Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow[J].J Clin Invest,2002;109:337-346.

    6 Krampera M,Glennie S,Dyson J et al.Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide[J].Blood,2003;101:3722-3729.

    7 Corcione A,Benvenuto F,F(xiàn)erretti E et al.Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions[J].Blood,2006;107:367-372.

    8 Segal B M.Experimental autoimmune encephalomyelitis:cytokines,effector T cells,and antigen-presenting cells in a prototypical Thl mediated autoimmune disease[J].Curr Allergy Asthma Rep,2003;3:86-93.

    9 Von Herrath M G,Harrison L C.Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity[J].Nat Rev Immunol,2003;3(2):223-232.

    10 Sakaguchi S.The origin of FOXP3-expressing CD4 regulatory T cells:thymus or periphery[J].J Clin Invest,2003;112:1310-1312.

    11 McGeachy M J,O'Connor R,Stephens L A et al.Antigen-based therapy and immune-regulation in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Methods Mol Biol,2007;380:313-326.

    12 Kassis I,Grigoriadis N,Gowda-Kurkalli B et al.Neuroprotection and immunomodulation with mesenchymal stem cells in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Arch Neurol,2008;65(6):753-761.

    13 Zappia E,Casazza S,Pedemonte E et al.Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy[J].Blood,2005;106(5):1755-1761.

    14 Nasef A,Chapel A,Mazurier C et al.Identification of IL-10 and TGF-beta transcripts involved in the inhibition of T-lymphocyte proliferation during cell contact with human mesenchymal stem cells[J].Gene Expr,2007;13:217-226.

    15 Fontenot J D,Gavin M A,Rudensky A Y.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Irnrnunol,2003;4:330-336.

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