漿細(xì)胞性乳腺炎患者外周血CD4+CD25+CD127－調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化①

付 嘉 熊 斌 司傳平 方艷秋 譚 巖 李繼斌

(濟寧醫(yī)學(xué)院免疫教研室，濟寧272067)

漿細(xì)胞性乳腺炎(Plasma cell mastitis，PCM)是一種非感染性良性乳腺炎癥［1］。PCM的病因至今不完全明了，更多的病理學(xué)的證據(jù)表明在PCM病灶局部浸潤大量漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、吞噬脂肪的泡沫細(xì)胞等［1，2］，提示機體自身免疫應(yīng)答在該病的進展中發(fā)揮重要作用。資料顯示CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞 (CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell，Treg)數(shù)量減少或功能異常與多種自身免疫病相關(guān)［3-5］，但對于 PCM 患者 CD4+CD25+Foxp3+Treg是否有變化國內(nèi)外未見報道。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究PCM患者共58例，年齡25～59歲，平均為(38.6±6.2)歲，均為經(jīng)產(chǎn)婦、非哺乳期婦女。術(shù)前細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查及術(shù)后冰凍切片檢查確認(rèn)為PCM。按照Hartley的方法根據(jù)臨床表現(xiàn)將 PCM 分為三期［8］:① 急性組 13例(22%):伴有乳房腫塊12例，乳頭溢液5例，乳腺疼痛10例，乳頭內(nèi)陷 6例;②亞急性組 25例(43%):伴有乳房腫塊23例，乳腺疼痛15例，乳頭溢液13例，乳頭內(nèi)陷9例，乳腺瘺形成4例;③慢性組20例(34%):伴有乳房腫塊15例，乳頭溢液12例，乳腺疼痛8例，乳頭內(nèi)陷15例，乳腺瘺形成9例，橘皮樣外觀10例，淋巴結(jié)腫大9例，見表1。

1.2 主要儀器與試劑 流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD公司);抗人 PE-Cy5-anti-CD4、Alexa Fluor488-anti-CD25、PE-anti-CD127及同型對照(均為 eBioscience)、TRIZOL(Invitrogen)，第一鏈cDNA合成試劑盒和 Oligo(dT)引物(均為 Fermentas);SYBR Green PCR Master Mix(Toyobo);實時熒光定量PCR檢測儀 ABI Prism 7900(Applied Biosystems);人TGF-β檢測試劑盒(eBioscience)。

1.3 方法

1.3.1 人CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞的檢測無菌取人抗凝靜脈血，肝素抗凝。取100 μl全血，分別加入抗人PE-Cy5-anti-CD4、Alexa Fluor488-anti-CD25、PE-anti-CD127 各5 μl，另設(shè)同型對照管，補償管，短時渦旋后4℃避光孵育20～30分鐘，加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，短時渦旋后室溫孵育15分鐘。以2 ml PBS 1 000 r/min離心洗滌5分鐘，棄上清，將細(xì)胞懸浮于0.5 ml PBS洗滌液中，振蕩混勻后上機檢測，圈定淋巴細(xì)胞為R1門內(nèi)細(xì)胞，CD4+細(xì)胞為R2門內(nèi)細(xì)胞，測定CD25+CD127-細(xì)胞占 CD4+細(xì)胞的百分率。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測人PBMC中Foxp3表達 引物設(shè)計:Foxp3引物P1:5'-GTGGCATCATCCGACAAGG-3'和 P2:5'-TGTGGAGGAACTCTGGGAAT-3'，GAPDH 引物 P3:5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'和 P4:5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。用Trizol試劑提取人PBMC總mRNA，用DNaseⅠ去除痕量DNA，分光光度計檢測RNA濃度。用第一鏈cDNA合成試劑盒和Oligo(dT)引物合成Foxp3 cDNA，用SYBR Green PCR Master Mix試劑及ABI Prism 7900熒光定量PCR儀定量檢測cDNA?；虻南鄬Ρ磉_量用△△CT法。GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參照，無模板樣本作為陰性對照。

1.3.3 ELISA法檢測人血漿TGF-β含量 無菌取人抗凝靜脈血，肝素抗凝。吸取血漿層凍于-80℃?zhèn)溆?。使用人TGF-β檢測試劑盒檢測血漿TGF-β含量，按照說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 各進展期PCM患者的臨床表現(xiàn) 統(tǒng)計各進展期PCM患者臨床表現(xiàn)，其中急性期13例(22%)，亞急性期25例(43%)，慢性期20例(34%)。各期PCM患者都出現(xiàn)乳房腫塊、乳房溢液、乳腺疼痛和乳頭內(nèi)陷等癥狀，亞急性期PCM患者還形成乳腺瘺(4/25)，慢性期患者還出現(xiàn)橘皮樣外觀和淋巴結(jié)腫大等癥狀(見表1)。

表1 PCM患者在各期的臨床表現(xiàn)Tab.1 Clinical manifestation of patients with plasma cell mastitis during three stages

2.2 PCM患者外周血中CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞百分率變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，三組PCM患者外周血CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分率均較正常組降低(P＜0.05)，其中急性期PCM組下降明顯(P＜0.01)。乳腺癌組CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞百分率與對照組相比，明顯升高(P＜0.05)。見圖1。

2.3 PCM患者外周血PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達變化 亞急性組PCM患者外周血PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達與正常組相比降低(P＜0.05)，急性期PCM組Foxp3表達下降明顯(P＜0.01)。乳腺癌組外周血PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達與對照組相比，明顯升高(P＜0.05)。見圖2。

2.4 PCM患者血漿TGF-β水平變化 三組PCM患者血漿TGF-β水平與正常組相比均降低(P＜0.05)，其中急性期PCM組血漿TGF-β水平下降明顯(P＜0.01)。乳腺癌組血漿TGF-β水平與對照組相比，明顯升高(P＜0.05)。見圖3。

圖1 PCM患者外周血中CD4+CD25+CD127－T細(xì)胞百分率變化Fig.1 Detection of CD4+CD25+CD127－cells in acute PCM，subacute PCM and chronic PCM

圖2 PCM患者外周血Foxp3 mRNA的表達Fig.2 Foxp3 mRNA expression in patients with PCM

圖3 PCM患者血漿TGF-β水平Fig.3 TGF-β concentration in plasma from patients with PCM

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)可根據(jù)來源不同分為自然 Treg(nTreg)和適應(yīng)性 Treg(iTreg)。nTreg在胸腺中分化、成熟，主要來源于CD4+CD25-胸腺細(xì)胞，在CD4+T細(xì)胞的自然選擇過程中生成并獲得CD4+CD25+Foxp3+表型。iTreg來自于外周的CD4+T細(xì)胞，包括三個亞群:Tr1、Th3和 Foxp3+表型 iTreg［7］。CD4+CD25+Treg 是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中最受關(guān)注的一群，其職能是維持機體自身耐受、控制移植排斥和超敏反應(yīng)，在感染和腫瘤時抑制效應(yīng)細(xì)胞功能，并防止自身免疫病的發(fā)生［9-12］。CD4+CD25+Treg占人和小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的5% ～10%，除高表達CD25(IL-2受體α鏈)外，還表達 CD127-、CD45RBlow、GITR、CTLA-4、LAG-3、CCR4、CCR7、CD62Lhigh及 neuropilin-1 等表面分子［7］。叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3(Forkhead/winged helix transcription factor)對CD4+CD25+Treg細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育和功能維持是必需的［13］。而Treg的另一個重要標(biāo)志CD127-(IL-7Ra-)常被用于區(qū)別于效應(yīng)性 CD4+T 細(xì)胞及其分離［6，7］。CD4+CD25+Treg的靶細(xì)胞涉及 CD4+CD25-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和DC，其作用于靶細(xì)胞的方式有:分泌抑制性細(xì)胞因子TGF-β1、IL-35和IL-10;細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸的溶細(xì)胞作用;干擾靶細(xì)胞代謝;調(diào)節(jié)DC的成熟及功能［7］。

漿細(xì)胞性乳腺炎(PCM)是一種以非周期性乳房疼痛、乳頭溢液、乳頭凹陷、乳暈區(qū)腫塊、非哺乳期乳房膿腫、乳頭部瘺管為主要臨床表現(xiàn)的炎癥樣特殊類型乳腺良性疾患，占乳房良性病變的4% ～5%。近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢［2］。PCM臨床表現(xiàn)復(fù)雜，故而命名也不盡相同，如乳管周圍型乳腺炎、乳管導(dǎo)管擴張癥等，有學(xué)者認(rèn)為每種病名僅反映其疾病過程的某一病理階段。根據(jù)Hartley的方法可將PCM分為三期［8］:急性期:具有乳腺急性炎癥的表現(xiàn)，可在乳暈周圍出現(xiàn)紅腫、疼痛，伴輕度發(fā)熱，全身中毒癥狀不明顯;亞急性期:急性炎癥已消退，遺留下硬結(jié)或腫塊，也可繼發(fā)感染形成乳腺瘺;慢性期:乳房腫塊縮小，可出現(xiàn)乳頭內(nèi)陷，甚至橘皮樣改變或淋巴結(jié)腫大，膿腫反復(fù)發(fā)作、破潰或形成竇道，腫塊可持續(xù)數(shù)年不等。PCM病理學(xué)證據(jù)表明乳腺導(dǎo)管周圍出現(xiàn)脂肪壞死及大量漿細(xì)胞浸潤，淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤，其中以漿細(xì)胞浸潤更為明顯，另有數(shù)量不等的泡沫狀組織細(xì)胞、多核巨細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞形成肉芽腫［14］。將PCM患者手術(shù)切除的乳腺病灶區(qū)組織勻漿接種于BALB/c小鼠，可建立PCM的動物模型［15］。提示PCM是一種自身免疫反應(yīng)參與的疾病。

由于PCM的臨床表現(xiàn)及輔助檢查無特異性，故極易誤診，其中1/3病例被誤診為乳腺癌。故而，在對PCM進行鑒別診斷時，排除乳腺癌是很重要的一個方面。研究顯示乳腺癌患者CD4+CD25+Treg數(shù)量明顯升高，參與癌癥的進展［16］。為研究在自身免疫病中發(fā)揮重要作用的CD4+CD25+Treg是否參與PCM的疾病發(fā)生與進展，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測三組不同進展期PCM患者及乳腺癌對照組患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞百分率;并以熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達，ELISA檢測血漿TGF-β含量。結(jié)果顯示，三組PCM患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg數(shù)量、外周血PBMC中Foxp3表達及血漿TGF-β水平均下降(P＜0.05)，其中急性PCM組下降最為明顯(P＜0.01)，提示PCM的疾病發(fā)生及進展可能涉及Treg功能紊亂及重新分布。結(jié)果同時顯示與PCM臨床癥狀易發(fā)生混淆的乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+CD127-Treg數(shù)量、外周血PBMC中Foxp3表達及血漿TGF-β水平均升高(P＜0.05)，與報道一致［16］。本研究顯示CD4+CD25+Treg在漿細(xì)胞乳腺炎疾病進展中發(fā)揮作用，并且對PCM患者CD4+CD25+Treg數(shù)量的檢測也可為乳腺癌的鑒別診斷提供線索。

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