血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)和意義①

王春紅 魏靜波 曲銀娥 田艷霞 薛素萍

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系，唐山063000)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，內(nèi)異癥)為子宮外子宮內(nèi)膜樣組織異常增生，是育齡婦女的常見病、多發(fā)病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。內(nèi)異癥雖為良性疾病，卻具有惡性疾病的生物學(xué)行為，易發(fā)生組織侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。新生血管形成是內(nèi)異癥發(fā)生的關(guān)鍵步驟和必備條件，異位內(nèi)膜本身及其周圍新生組織血供的建立和維持是子宮內(nèi)膜異位種植存活和組織侵襲及轉(zhuǎn)移發(fā)展的基本條件。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是目前公認(rèn)最重要的促血管生成因子［2］，必須與其受體結(jié)合才能發(fā)揮其相應(yīng)的作用，VEGFR1是絡(luò)氨酸激酶受體［3］，屬VEGF受體成員之一。本研究采用免疫組化及Western blot方法檢測(cè)VEGF及其受體VEGFR1在異位癥在位及異位內(nèi)膜的表達(dá)及定位，探討VEGF/VEGFR1在內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011年9月至2012年9月河北省唐山市婦幼保健醫(yī)院收治的經(jīng)開腹或腹腔鏡手術(shù)的內(nèi)異癥患者34例，排除同時(shí)合并內(nèi)異癥、子宮腺肌癥和子宮肌瘤者，年齡(36.0±1.43)歲，同時(shí)刮取在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜，其中增生期14例，分泌期20例。另選取同期內(nèi)34例行絕育手術(shù)或患子宮肌瘤等良性病變需手術(shù)的患者作為對(duì)照組，均排除患有內(nèi)異癥，(38.2±2.13)歲，其中增生期16例，分泌期18例。所有入選對(duì)象術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受放療、化療、激素治療及手術(shù)治療，無其他腫瘤病史及全身性疾病。所取組織均經(jīng)病理學(xué)診斷，并依據(jù)HE染色及月經(jīng)周期分為增生期和分泌期。

1.2 標(biāo)本采集與方法 患者知情同意前提下，術(shù)中取子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，保留子宮者于術(shù)前或術(shù)中刮取子宮內(nèi)膜組織，切除子宮者切取子宮內(nèi)膜組織，腹腔鏡術(shù)中留取卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁組織，所取標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗后，部分入液氮冷卻30分鐘后，置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，部分?jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

1.2.1 主要試劑 兔抗人VEGF單克隆抗體、VEGFR1多克隆抗體、GAPDH單克隆抗體分別購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司、Abcam公司及Sigma公司，兔即用型免疫組化試劑盒購自北京四正柏科技生物有限公司;BCIP/NBT顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 SP法檢測(cè)各組內(nèi)膜組織中VEGF及VEGFR1蛋白表達(dá)，步驟如下:(1)切片常規(guī)脫蠟至水，微波90秒修復(fù)抗原，3%H2O2孵育10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉20分鐘;(2)滴加一抗，VEGF及VEGFR1工作濃度均為1∶100，濕盒4℃孵育過夜;(3)滴加生物素化山羊抗兔二抗，濕盒37℃孵育30分鐘;(4)滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，濕盒37℃孵育20分鐘;(5)PBS洗5分鐘×4次，DAB顯色，自來水終止顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。同時(shí)以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果分析:高倍鏡下，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)包含子宮腺的視野，采用顯微成像系統(tǒng)拍照，利用Image-pro-plus圖像分析軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，分別測(cè)量EMs組異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜與對(duì)照組陽性細(xì)胞的平均光密度(MOD)值，代表蛋白表達(dá)量，計(jì)算各組的平均光密度。

1.2.3 Western blot分析 -80℃冰箱中取出內(nèi)膜組織，加細(xì)胞裂解液冰上勻漿提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每孔50 μg總蛋白，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，經(jīng)電轉(zhuǎn)印(濕轉(zhuǎn))將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)，加入相應(yīng)一抗(抗體工作濃度 VEGF及 VEGFR1為1∶500，GAPDH 為1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3次，加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育2小時(shí)，TBST洗膜3次，置條帶于避光顯色盒中，加入BCIP/NBT顯色液，室溫孵育1～5分鐘，自來水終止顯色，方正掃描儀掃描條帶，Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以VEGF或VEGFR1與GAPDH條帶的相對(duì)吸光度值作為VEGF或VEGFR1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 VEGF和VEGFR1蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)與分布 棕黃色染色為陽性細(xì)胞。VEGF、VEGFR1蛋白均主要表達(dá)于三組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞漿及胞膜，間質(zhì)細(xì)胞中有散在表達(dá)(圖1)。

2.2 各組內(nèi)膜組織中VEGF及VEGFR1蛋白表達(dá)水平比較 免疫組化結(jié)果顯示:無論增生期還是分泌期，異位癥患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜VEGF和VEGFR1蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組同期內(nèi)膜，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而異位癥在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1，表1)。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果與免疫組化一致(圖2，表1)。

表1 各組內(nèi)膜VEGF和VEGFR1蛋白比較(MOD，±s)Tab.1 The expression of VEGF and VEGFR1 proteins in each group(MOD，±s)

表1 各組內(nèi)膜VEGF和VEGFR1蛋白比較(MOD，±s)Tab.1 The expression of VEGF and VEGFR1 proteins in each group(MOD，±s)

Note:Secretory phase vs proliferative phase，1)P ＜0.05;EMs vs control group，2)P ＜0.05.

Groups n Immunohistochemistry Western blot VEGF VEGFR1 VEGF VEGFR1 Proliferative phase Endometrium of control 16 0.078±0.028 0.376±0.068 0.068±0.017 0.287±0.087 Eutopic endometrium of EMs 14 0.682±0.0262) 0.684±0.1102) 0.691±0.1612) 0.697±0.1662)Ectopic endometrium of EMs 14 0.686±0.0222) 0.689±0.0412) 0.685±0.1132) 0.686±0.1312)Secretory phase Endometrium of control 18 0.113±0.0131) 0.414±0.0691) 0.125±0.0121) 0.359±0.0211)Eutopic endometrium of EMs 20 0.689±0.0562) 0.696±0.1672) 0.701±0.1572) 0.704±0.1222)Ectopic endometrium of EMs 20 0.692±0.1152) 0.702±0.1512) 0.698±0.1242) 0.671±0.1272)

2.3 VEGF及VEGFR1蛋白表達(dá)與月經(jīng)周期的關(guān)系 免疫組化及蛋白印跡結(jié)果均顯示，VEGF和VEGFR1蛋白表達(dá)水平在對(duì)照組子宮內(nèi)膜中均為分泌期高于增殖期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而內(nèi)異癥在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織中，VEGF和VEGFR1蛋白增生期及分泌期均為高表達(dá)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1、2，表1)，提示內(nèi)異癥內(nèi)膜組織中VEGF和VEGFR1蛋白表達(dá)失去周期性變化。

圖1 VEGF及VEGFR1蛋白在各組內(nèi)膜組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×200)Fig.1 The expression of VEGF/VEGFR1 protein in each group(Immunohistochemistry，×200)

圖2 Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of Western blot

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥雖為婦科常見的良性病變，但卻有易侵襲和易復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為。內(nèi)異癥的發(fā)生、發(fā)展涉及很多因素，其發(fā)病機(jī)理尚不明了。研究表明內(nèi)異癥的發(fā)生、發(fā)展有賴于新生血管的形成［4］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)促血管生成因子之一，為特異性的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂劑，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生，毛細(xì)血管袢形成，促進(jìn)體內(nèi)新生血管的生成。VEGF單體無生物學(xué)活性，但與內(nèi)皮細(xì)胞上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(VEGFR1)有高度的親和力，結(jié)合后可作為內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原發(fā)揮促血管生成作用［5］。

本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜中 VEGF、VEGFR1表達(dá)均高于對(duì)照組內(nèi)膜，提示內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜存在異常的生物學(xué)活性，具有更強(qiáng)的血管生長(zhǎng)能力和增殖活性，與Almog等［6］的研究結(jié)果相同，支持郎景和的“在位內(nèi)膜決定論”。VEGF具有促血管形成的功能［7-10］，一方面，VEGF特異性地與內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR1受體結(jié)合，刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，直接參與血管生成;另一方面，當(dāng)內(nèi)異癥患者的子宮內(nèi)膜隨經(jīng)血逆流入腹腔后，形成最初微小內(nèi)異癥異位病灶，異位病灶受月經(jīng)周期調(diào)節(jié)而周期性生長(zhǎng)，卻缺乏在位子宮內(nèi)膜基底層的血液供應(yīng)，造成異位病灶組織生長(zhǎng)的相對(duì)缺氧狀態(tài)。缺氧可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生新的缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α蛋白，而VEGF是HIF-1α重要的靶基因，缺氧機(jī)制在基因水平可直接上調(diào)VEGF的表達(dá)，誘導(dǎo)新生血管的生成［8］。然而新生血管結(jié)構(gòu)不完善，如基膜薄、細(xì)胞間缺乏緊密連接等，易發(fā)生滲漏和出血，不但不能改善組織缺氧，反而誘發(fā)更多的生長(zhǎng)因子和新生血管形成，促進(jìn)內(nèi)異癥的進(jìn)一步發(fā)展。隨著異位內(nèi)膜不斷生長(zhǎng)，血液供應(yīng)的相對(duì)不足引起異位內(nèi)膜組織細(xì)胞的相對(duì)缺氧，缺氧又反饋性地引起VEGF、VEGFR1的表達(dá)，循環(huán)往復(fù)，致使異位內(nèi)膜不斷侵襲，引起腹腔粘連而導(dǎo)致一系列并發(fā)癥。我們前期研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥增生期在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜HIF-1α和VEGF表達(dá)均高于對(duì)照組，且 HIF-1α 和 VEGF呈正相關(guān)關(guān)系［9］。Sharkey等［10］研究也發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子大量分泌。VEGF通過自分泌途徑刺激自身表達(dá) VEGFR1［11］。Joseph 等［12］實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血管的發(fā)芽與VEGFR1有關(guān)，確定血管發(fā)芽即新血管生成的位置，VEGFR1即可對(duì)VEGF蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。VEGF與VEGFR1聯(lián)合調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞分化、增加微血管通透性［13］，通過引起血漿蛋白的高度通透性而誘導(dǎo)間質(zhì)產(chǎn)生，促進(jìn)血管的生長(zhǎng)，為異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)提供血液供應(yīng)。同時(shí)，VEGF可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMPs等多種組織因子和組織蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，削弱基質(zhì)的屏障作用，使新生血管基底膜缺損加重，促進(jìn)血管生長(zhǎng)，有利于異位內(nèi)膜的種植、存活，而異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)又可表達(dá)更多的VEGF，進(jìn)一步促進(jìn)血管增生，形成了一種惡性循環(huán)。

綜上所述，內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜子宮腺上皮及其基質(zhì)中高表達(dá)VEGF及VEGFR1蛋白，可能通過多種途徑促進(jìn)異位內(nèi)膜血管生成，在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入，對(duì) VEGF小干擾 RNA、抗 VEGF抗體、VEGF受體拮抗劑及血管生成抑制劑的研究有望為有效阻斷異位病灶遠(yuǎn)處種植、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移提供基因治療的新靶點(diǎn)。

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