豬牙皂正丁醇提取物含藥血清抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的實(shí)驗(yàn)研究*

汪紅衛(wèi) 張赤志 許漢林 陳 成 蔡 岳 王曉東

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)2010級博士生部 (湖北武漢，430061) 2.湖北省中醫(yī)院 3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 4.湖北中醫(yī)藥大學(xué)2012級博士生部

原發(fā)性肝癌是一種全球性高度惡性的腫瘤［1］，病機(jī)十分復(fù)雜。中醫(yī)對其治療有許多探討，從痰論治原發(fā)性肝癌［2］是主要方法之一，涉及多味化痰中藥［3，4］，皂莢為其中一種［5］。豬牙皂為豆科植物皂莢已衰老或受傷后所結(jié)之果實(shí)，彎曲成月牙形，又稱小皂莢［6］;性味辛咸、溫、有毒;入肺、胃、大腸經(jīng)，《湯液本草》云:“入厥陰經(jīng)”;功用:通竅、滌痰、搜風(fēng)、殺蟲［7］。本實(shí)驗(yàn)采用豬牙皂正丁醇提取物的含藥血清，體外實(shí)驗(yàn)抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，利用噻唑藍(lán)還原法(MTT法)檢測其抑制率，以觀察豬牙皂的抗肝癌效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動物 人肝癌SMMC-772l細(xì)胞，購于基爾頓生物科技 (上海)有限公司。Wistar雄性大鼠40只，SPF級，體重 (200±20)g，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，許可證號:SCXK(鄂)2008-005。

1.2 藥物 中藥豬牙皂購于湖北省藥材公司，豬牙皂正丁醇提取物由湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 微量移液器 (芬蘭大龍移液器)、超凈工作臺 (蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司，型號SW-CJ-1FD)、CO2恒溫培養(yǎng)箱 (SANYO公司，型號 MCO-15AC)、倒置顯微鏡 (OLYMPUS公司，型號IX51)、低溫離心機(jī) (OLYMPUS公司，型號IX51)、低速離心機(jī) (Eppendorf公司，型號 5702R)、酶標(biāo)儀 (Thermo公司，型號 MULTISKAN MK3)。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材 0.25%胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒為南京凱基生物科技公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)皿及細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

1.5.1 豬牙皂正丁醇提取物含藥血清的制備 40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為4組，即:對照組，正丁醇提取物含藥血清按低、中、高劑量組，每組10只大鼠。根據(jù)人臨床用量(豬牙皂生藥量1.5g·70kg-1·d-1)、人與大鼠的等效劑量倍數(shù)，倍增至7倍為實(shí)驗(yàn)低劑量，按1∶2∶4，設(shè)置正丁醇提取物低劑量 (0.15g·kg-1·d-1)組、中劑量 (0.3g·kg-1·d-1)組和高劑量 (0.6g·kg-1·d-1)組，用生理鹽水稀釋至等體積灌胃給藥，對照組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)2天。第3天上午再給全日劑量灌胃1次 (灌胃前禁食不禁水12小時(shí))，于給藥后0.5～1小時(shí)，心臟采血，離心分離血清，合并同組血清，56℃水浴滅活30分鐘，用0.22 μm一次性無菌濾器過濾除菌、分裝，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞長滿單層鋪滿培養(yǎng)瓶后，加入適量0.25%的胰蛋白酶液消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 MTT法測定細(xì)胞抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別收集計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為4×104個(gè)/ml，96孔板每孔接入100μl細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)空白對照組，即孔內(nèi)加入100μl DMEM培養(yǎng)基，不含細(xì)胞，再加入200μl無菌PBS;每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí);吸出孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，加入預(yù)先配置好的含藥血清 DMEM培養(yǎng)基200μl(DMEM:含藥血清 =180μl∶20μl)，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí);小心吸出孔內(nèi)液體，加入預(yù)先配置好混勻的含MTT的 DMEM 培養(yǎng)基 100μl(DMEM:MTT=90μl:10μl)，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí);小心吸出孔內(nèi)液體，加入二甲基亞砜 (Gibco公司)150μl/孔，室溫低速振蕩10～15分鐘，使紫色結(jié)晶充分溶解;用酶標(biāo)儀測定各孔在波長為492 nm時(shí)光密度值(optical density，OD)，細(xì)胞抑制率計(jì)算公式:生長抑制率 (%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

2 結(jié)果

表1 豬牙皂正丁醇提取物含藥血清對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721存活的影響(，n=5)

表1 豬牙皂正丁醇提取物含藥血清對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721存活的影響(，n=5)

*與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;△與高劑量組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 豬牙皂提取物正丁醇部位含藥血清對人SMMC-7721肝癌細(xì)胞的存活影響(檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.008)

如表1和圖1結(jié)果所示:低劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與高劑量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高劑量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥治療中最常見到效果的腫瘤之一，中醫(yī)以整體觀念根據(jù)患者的全身特點(diǎn)辨證論治，可以適用于各型各期肝癌［8］。藥物體外抑制肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)較多，大多結(jié)論提示:對肝癌細(xì)胞的抑制效果隨著藥物劑量的增加而增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻提示:豬牙皂正丁醇提取物中、低劑量組能夠抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，高劑量組卻沒有抑制作用。

藥物在機(jī)體產(chǎn)生的藥理作用和效應(yīng)，受藥物和機(jī)體多種因素的影響。藥物因素主要有藥物劑型、劑量和給藥途徑、合并用藥與藥物相互作用等;機(jī)體因素主要有年齡、性別、種族、遺傳變異、心理、生理和病理因素［9］。合理用藥，需要結(jié)合藥物代謝動力學(xué)和臨床、實(shí)驗(yàn)具體方案，來調(diào)控藥物作用的性質(zhì)、強(qiáng)度和時(shí)間，以增強(qiáng)療效，防止和減輕其毒副作用［10］。本實(shí)驗(yàn)藥物劑量與效應(yīng)關(guān)系，與藥物動力學(xué)最大效應(yīng)的概念一致，即:最大效應(yīng)隨著劑量或濃度的增加，效應(yīng)也增加，當(dāng)效應(yīng)增加到一定程度后，若繼續(xù)增加藥物濃度或劑量而其效應(yīng)不再繼續(xù)增強(qiáng)，這一藥理效應(yīng)的極限稱為最大效應(yīng)。這種現(xiàn)象與臨床中藥物的“天花板效應(yīng)”相似，如:像弱阿片類中的部分激動劑，因?yàn)楹褪荏w結(jié)合后只產(chǎn)生部分效應(yīng)，而隨著與受體結(jié)合的增多，反而會產(chǎn)生拮抗作用。這提示我們實(shí)驗(yàn)與臨床用藥時(shí)應(yīng)尋找最佳藥效的藥物劑量，但這一現(xiàn)象的確切原因和機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究和探討。

［1］胡品津，劉新光.消化內(nèi)科學(xué) ［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:188.

［2］汪紅衛(wèi)，張赤志，蔡岳，等.從痰瘀論治原發(fā)性肝癌 ［J］.國際中醫(yī)中藥雜志，2013，35(2)，145-146.

［3］楊宗輝，尹建元，魏征人，等.天南星提取物誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.中國老年學(xué)雜志，2007，27(2):142-144.

［4］王慶才.生南星、生半夏在腫瘤臨床中的應(yīng)用［J］.遼寧中醫(yī)雜志，1993，20(3):37-38.

［5］杜進(jìn)軍，張赤志，許漢林，等.皂莢提取物對肝癌細(xì)胞小鼠Smad4及Smad7基因調(diào)控的影響 ［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2010，20(3):164-165，177.

［6］高學(xué)敏.中藥學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)出版社，2007:351.

［7］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986:2198.

［8］中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會，中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專業(yè)委員會，中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會肝癌學(xué)組.原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治的專家共識［J］.臨床肝膽病雜志，2009，25(2):91.

［9］楊寶峰.藥理學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:27-36.

［10］徐淑云.臨床藥理學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:33.