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    抗動(dòng)脈粥樣硬化基因在人主動(dòng)脈與冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系的表達(dá)

    2013-11-27 08:23:30朱詩(shī)白丁文超劉瑞敏孫伊儻劉明鎖唐一鳴姬新穎馬遠(yuǎn)方白慧玲
    關(guān)鍵詞:主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞硬化

    朱詩(shī)白,丁文超,劉瑞敏 ,孫伊儻,劉明鎖,唐一鳴,李 濤,姬新穎,馬遠(yuǎn)方,白慧玲

    (河南大學(xué) 免疫學(xué)研究所,細(xì)胞與分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 開封475004)

    動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是隨著人的年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)的血管免疫性炎癥疾?。?]。與此關(guān)聯(lián)的冠心病在國(guó)內(nèi)平均患病率為6.49%,據(jù)此我國(guó)有2 000萬(wàn)冠心病患者,對(duì)家庭和國(guó)家造成非常巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。冠狀動(dòng)脈近側(cè)段之所以好發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化是由于它比所有器官的動(dòng)脈都靠近心室,因而承受最大的收縮壓撞擊。這些部位的血流動(dòng)力學(xué)比較特殊,很可能影響局部血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)。因此加強(qiáng)血液動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)和內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)關(guān)系的研究,對(duì)冠心病的防治具有十分重要的意義[2]。為探討動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的分子機(jī)制,我們總結(jié)了50種與動(dòng)脈硬化的發(fā)生密切有關(guān)基因,見表2。我們初步檢測(cè)了人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的多種基因的表達(dá),比較其表達(dá)差異,檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有4種基因在人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)明顯差異。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株HCAEC及人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株HAEC(美國(guó)ScienCell)及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM(美國(guó)ScienCell),購(gòu)至上海復(fù)蒙生物科技有限公司;實(shí)時(shí)定量PCR儀RG 6000型(澳大利亞Corbett公司),TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司),Sybr green PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)公司),引物合成(北京金唯智公司)。紫外分光光度儀(Beckman公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HCAEC及 HAEC,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度3×106/mL,用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清 RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)培養(yǎng),接種于24孔培養(yǎng)板,24h后換用低血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM培養(yǎng)液24h,換液后即可用于實(shí)驗(yàn)。倒置顯微鏡下細(xì)胞呈單層鵝卵石狀生長(zhǎng),臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力大于97%。

    1.2.2 總RNA提取和cDNA的獲取 使用TRIzol提取人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞總RNA(具體按試劑說(shuō)明操作),以DEPC水溶解。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作將獲得的mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。

    1.2.3 半定量RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá)量 將獲得的HCAEC及HAEC cDNA稀釋至100ng/μl,以β-actin作為內(nèi)參,反應(yīng)體系和條件按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用于4種基因RT-PCR的引物序列,見表1。反應(yīng)結(jié)束后,取反應(yīng)產(chǎn)物10μL進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,在UV-254紫外透射反射分析儀上觀察結(jié)果,并用數(shù)碼凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并攝像,照片進(jìn)行圖像分析。

    表1 用于基因RT-PCR的引物序列

    2 結(jié)果

    2.1 5種基因在人主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)

    RT-PCR結(jié)果顯示可見 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1、ICAM2的mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物片段分別位于相當(dāng)與 Mr200bp、260bp、200bp、200bp、100bp的位置,與預(yù)期理論值大小一致(圖1),產(chǎn)物特異,條帶清晰。

    2.2 5種基因在人主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)差異

    根據(jù)我們的前期研究工作基礎(chǔ),以及文獻(xiàn)檢索結(jié)果,我們初步判斷出50種與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)的基因(表2),有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,而我們檢測(cè)的4種基因(VEGF、COX-2、ENOS、ZO-1)正是表中總結(jié)的抗動(dòng)脈粥樣硬化基因(+表示),4種基因的表達(dá)特點(diǎn)是在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平均高于人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,而ICAM2是表2中顯示動(dòng)脈粥樣硬化基因,特點(diǎn)是在冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)高于主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(圖1)。

    圖1 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1、ICAM2在人主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)注:A-HAEC;B-HAC;1-VEGF;2-COX-2;3-eNOS;4-ZO-1;5-ICAM2

    表2 我們研究的50種基因在AS中的作用,檢索分析結(jié)果

    3 討論

    動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病。在粥樣斑塊中存在許多免疫細(xì)胞,而且在不穩(wěn)定斑塊中尤為豐富。近年來(lái)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中免疫細(xì)胞的聚集、分化和激活有了更深入的了解[3]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了多種與其相關(guān)的病毒和細(xì)菌感染。通過研究初步確定了幾個(gè)自身性抗原,并提出了自身免疫假說(shuō)。根據(jù)這些新的認(rèn)識(shí),提出了免疫調(diào)節(jié)和預(yù)防接種等心血管疾病的新的預(yù)防和治療策略[4]。這必將極大地提高對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的研究和防治水平。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制中,免疫學(xué)說(shuō)越來(lái)越引起人們的重視。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞在粥樣硬化斑塊中聚集,說(shuō)明免疫在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中也起作用。加強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化免疫機(jī)制的研究,確定動(dòng)脈粥樣硬化的免疫學(xué)性質(zhì),尤其探索天然免疫在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生早期的作用,有助于徹底闡明動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制。

    動(dòng)脈粥樣硬化最早的改變?yōu)檠軆?nèi)皮細(xì)胞功能異常[7]。作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的力有2種:流體對(duì)管壁的剪應(yīng)力(wall shear stress,WSS)和固體周圍牽張力(circumferential strain,CS),前者是由血流驅(qū)動(dòng)的,血管長(zhǎng)軸平行;而后者則是由血壓驅(qū)動(dòng)引起的,是垂直于血管壁的環(huán)形張力,作用于血管壁所有細(xì)胞。這2種力同時(shí)作用于襯于血管的內(nèi)皮細(xì)胞,從而可以調(diào)節(jié)其表型。在動(dòng)脈粥樣硬化最顯著的循環(huán)部位如冠狀動(dòng)脈,CS和 WSS是非常不同步的[8]。故認(rèn)為血液動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)[9]。相對(duì)于冠狀動(dòng)脈,主動(dòng)脈為不易發(fā)生粥樣硬化的部位,為了探討主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈的血液動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)對(duì)粥樣硬化形成的影響,我們選擇檢測(cè)5種與免疫學(xué)相關(guān)的基因并比較在主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá),四種基因 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1均為我們?cè)诔醪窖芯拷Y(jié)果的基礎(chǔ)上經(jīng)過檢索確定的可能為抗動(dòng)脈粥樣硬化的基因,而我們的檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了我們的推測(cè),主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞較冠狀動(dòng)脈更易表達(dá) VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1。而ICAM2為動(dòng)脈粥樣硬化基因,冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞較主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)ICAM2,可能使其易發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。

    表2中基因的作用是根據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果,我們課題組初步確定的,共有“動(dòng)脈粥樣硬化易感基因”21種(-表示),“動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)基因”27種(+表示),另有兩種基因APOA與APOB作用尚無(wú)確定。我們檢測(cè)只是我們的初步驗(yàn)證,根據(jù)我們的前期研究,我們推測(cè)在不同的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有不同的特異基因的表達(dá),在冠狀動(dòng)脈等動(dòng)脈粥樣硬化好發(fā)部位,由于血液動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)WSS和CS不同步性高,使得兩類基因的表達(dá)失衡,基因表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化性特點(diǎn);而在主動(dòng)脈等動(dòng)脈粥樣硬化非好發(fā)部位,WSS和CS同步性較好,其基因表達(dá)呈現(xiàn)抗動(dòng)脈粥樣硬化性特點(diǎn)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)檢索結(jié)果[10]我們認(rèn)為正常情況下,動(dòng)脈保護(hù)性基因與動(dòng)脈粥樣硬化性基因處于平衡狀態(tài),而在動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)區(qū),平衡易被打破,造成動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病,該假設(shè)我們將進(jìn)一步通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)并修改。

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